肉桂（Cinnamomum verum）与百里香（Thymus vulgaris）精油对棕榈蓟马（Thrips parvispinus）的杀虫潜力：分子对接与机制研究

《Journal of Natural Pesticide Research》：Molecular docking and mechanistic insights into the insecticidal potential of Cinnamomum verum and Thymus vulgaris essential oils against Thrips parvispinus

　　

本研究旨在评估十种植物精油对棕榈蓟马（Thrips parvispinus Karny）的杀虫活性，并探究其作用机制。棕榈蓟马是辣椒最具破坏性的害虫之一，近年来暴发可导致80%–100%的作物损失。农民过度依赖合成杀虫剂已导致害虫再增猖獗、抗药性产生、残留积累以及环境和人类健康危害，因此亟需环境友好型替代方案。植物精油（Essential Oils, EOs）作为挥发性次生代谢物，因其多靶标作用模式、快速降解、低哺乳动物毒性及与有害生物综合治理（Integrated Pest Management, IPM）的兼容性而备受关注。

研究人员通过叶碟法（leaf-dip method）对小豆蔻（Elettaria cardamomum）、肉桂（Cinnamomum verum）、肉桂树皮（C. verum bark）、桉树（Eucalyptus globulus）、玫瑰草（Cymbopogon martini）、百里香（Thymus vulgaris）、万寿菊（Tagetes patula）、依兰（Cananga odorata）、 therebylα天竺葵（Pelargonium hortorum）及香根草（Chrysopogon zizanioides）十种精油进行了初步筛选。结果表明，肉桂树皮油和百里香油对棕榈蓟马表现出最高杀虫活性，因此被选定用于后续深入研究。

气相色谱-质谱联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry, GC-MS）分析鉴定了肉桂树皮油中的主要生物活性成分为3-烯丙基-6-甲氧基苯酚（28.94%），以及百里香油中的百里香酚（27.09%）、γ-萜品烯（14.30%）和对伞花烃（12.80%）。对五种主要单体化合物（α-蒎烯、对伞花烃、香叶醇、桉叶油醇和百里香酚）的单独生物测定显示，百里香酚（LC₅₀=1.77 μl/ml）、α-蒎烯（LC₅₀=1.83 μl/ml）和对伞花烃（LC₅₀=1.92 μl/ml）致死率最高（92.5%），其次为香叶醇（87.5%）和桉叶油醇（85.0%）。二元混合物试验显示拮抗效应。

酶活性测定表明，精油处理显著调节了棕榈蓟马的解毒酶和神经酶活性。肉桂树皮油处理组总蛋白含量最高（38.36 μg/ml），其次为百里香油（35.25 μg/ml）。酯酶（Esterase, EST）活性以百里香油处理最高（0.28 U/mg），其次为肉桂树皮油（0.19 U/mg）；乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase, AChE）活性以肉桂树皮油处理最高（0.44 U/mg），其次为百里香油（0.31 U/mg）；谷胱甘肽-S-转移酶（Glutathione S-transferase, GST）活性以百里香油处理最高（0.61 U/mg），其次为肉桂树皮油（0.21 U/mg）。AChE抑制试验显示，肉桂树皮油IC₅₀为0.091 μl/ml，显著低于百里香油的1.48 μl/ml，表明其16倍更强的抑制 potency。

由于目前尚无棕榈蓟马AChE的实验解析结构或数据库收录序列，研究人员采用近缘种西方花蓟马（Frankliniella occidentalis）AChE作为替代靶标进行同源建模（UniProt登录号A0A9C6U0G9）。模型经拉氏图（Ramachandran plot）和ProSA-web验证，17个残基位于不允许区域，Z-score为-8.23。分子对接采用SeeSAR v10.3.1软件，以结合位点引导的配体放置和HYDE评分函数进行评估。

对接结果显示，肉桂树皮油中2-甲基二十四烷（2-methyltetracosane）表现出最高预测亲和力（ΔG = -75.09 kJ/mol；Ki 0.000007–0.001 nM）；百里香油中诱虫十三烯（muscalure, ΔG = -66.14 kJ/mol）、新植二烯（neophytadiene, ΔG = -63.36 kJ/mol）和油醇乙酸酯（oleyl acetate, ΔG = -60.29 kJ/mol）为主导活性成分。配体主要由疏水相互作用、π-烷基相互作用和范德华相互作用稳定，桉叶油醇额外与Thr292形成氢键。配体效率（Ligand Efficiency, LE）值随分子量增加而下降，亲脂配体效率（Lipophilic Ligand Efficiency, LLE）值以中等亲脂性单萜最高。

综上所述，肉桂树皮油和百里香油对棕榈蓟马具有显著杀虫活性，其作用机制涉及对AChE的抑制及解毒酶系统的干扰。分子对接研究进一步支持了这些精油成分作为AChE抑制剂的潜力，为开发环境友好型植物源农药提供了理论基础。

本研究针对棕榈蓟马（Thrips parvispinus）这一辣椒毁灭性害虫的防治难题，探讨了植物精油作为合成杀虫剂替代品的潜力。棕榈蓟马于2021年以来成为辣椒生产的新发威胁，其短生命周期（15–20天）、隐蔽取食习性以及频繁用药导致的抗药性和再增猖獗问题，使得传统杀虫剂防治效果日益下降，同时还造成环境污染、农产品残留超标及出口价值降低等严重后果。在此背景下，开发环境友好型、可持续的害虫治理策略成为当务之急。植物精油作为天然挥发性次生代谢物，具有多靶标作用模式、快速降解、低哺乳动物毒性及与有害生物综合治理（Integrated Pest Management, IPM）兼容等优势，且多数已被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）和美国环境保护署（Environmental Protection Agency, EPA）列为"公认安全"（Generally Recognized as Safe, GRAS）物质，因此成为理想的生物农药候选来源。

尽管已有研究综述了菊科（Asteraceae）、芸香科（Rutaceae）、伞形科（Apiaceae）、唇形科（Lamiaceae）和桃金娘科（Myrtaceae）等植物精油的杀虫潜力，但针对棕榈蓟马的精油毒性研究显著匮乏，且市场上缺乏稳定的精油制剂产品，限制了其实际应用。基于此，研究人员开展了系统性研究，旨在通过严格的生物测定筛选高效杀虫精油，利用气相色谱-质谱联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry, GC-MS）解析活性成分，并评估其对入侵性害虫棕榈蓟马的生物效力，以期为植物源害虫治理策略提供科学依据。

研究过程中，研究人员于2024–2025年在印度农业研究委员会-印度园艺研究所（ICAR-IIHR）蔬菜昆虫学实验室开展了全部实验。所用十种精油购自Falcon Essential Oils公司，五种单体化合物购自Sigma Aldrich公司。棕榈蓟马种群在防虫网室内以辣椒品种Arka Khyati为寄主，经3–4代继代培养建立实验种群。生物测定采用叶碟法（leaf-dip method），精油设6个浓度（0.1–3.2 μl/ml），单体化合物设5个浓度（0.3–2.4 μl/ml），每浓度4次重复，每处理10头2龄幼虫，于25±0.5°C、65±5%相对湿度条件下培养，分别于24 h和48 h记录死亡率。GC-MS分析参照Prasannakumar等人（2025）的方法进行。酶活性测定采用Lowry法测定总蛋白含量，以α-萘乙酸酯为底物测定酯酶（Esterase, EST）活性，以1-氯-2,4-二硝基苯（1-chloro?2,4-dinitrobenzene, CDNB）和还原型谷胱甘肽（reduced glutathione, GSH）为底物测定谷胱甘肽-S-转移酶（Glutathione S-transferase, GST）活性，以碘化硫代乙酰胆碱（acetylthiocholine iodide, ATChI）为底物测定乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase, AChE）活性。因缺乏棕榈蓟马AChE的实验解析结构，研究人员以近缘种西方花蓟马（Frankliniella occidentalis）AChE为替代靶标，通过MODELLER v9.24进行同源建模，经拉氏图（Ramachandran plot）和ProSA-web验证后，采用SeeSAR v10.3.1软件进行分子对接，配体结构来自PubChem数据库并经ChemDraw Ultra 11.0优化，以HYDE评分函数评估结合亲和力。AChE抑制试验采用四参数逻辑（4-parameter logistic, 4PL）非线性回归模型拟合剂量-反应数据，估计半数抑制浓度（IC₅₀）和Hill斜率。

**实验室筛选结果**：初步括弧试验表明，十种精油对棕榈蓟马的致死效果差异显著。肉桂树皮油（C. verum bark） mortality从0.1 μl/ml时的20.0%升至2.0 μl/ml时的80.0%，百里香油（T. vulgaris）从0.1 μl/ml时的23.33%升至3.2 μl/ml时的86.67%，为所有供试精油中杀虫活性最高的两种。其他精油效果相对较低。

**肉桂树皮油与百里香油生物效力**：精细生物测定显示，肉桂树皮油在2.5 μl/ml时致死率达85.0%，LC₃₀为0.31（95%置信区间：0.02–0.63）μl/ml，LC₅₀为0.84（0.32–1.94）μl/ml，LC₉₀为9.75（3.30–13.61）μl/ml；百里香油在3.5 μl/ml时致死率达90.0%，LC₃₀为0.56（0.25–0.86）μl/ml，LC₅₀为1.16（0.73–1.68）μl/ml，LC₉₀为6.58（3.78–22.13）μl/ml。结果表明肉桂树皮油以更低浓度即可达到50%致死效果，效力更高。

**GC-MS活性成分鉴定**：肉桂树皮油共鉴定出33种化合物，主要成分为3-烯丙基-6-甲氧基苯酚（28.94%）；百里香油同样检出33种成分，以百里香酚（27.09%）、γ-萜品烯（14.30%）和对伞花烃（12.80%）为主要活性成分。

**单体化合物生物效力**：五种单体化合物中，百里香酚（LC₅₀=1.77 μl/ml）、α-蒎烯（1.83 μl/ml）和对伞花烃（1.92 μl/ml）致死率最高（92.5%），香叶醇（2.43 μl/ml, 87.5%）和桉叶油醇（2.59 μl/ml, 85.0%）次之。α-蒎烯+对伞花烃、α-蒎烯+百里香酚、桉叶油醇+香叶醇、百里香酚+香叶醇的二元混合物均表现为拮抗效应。

**酶活性变化**：精油暴露显著调节了棕榈蓟马的解毒酶和神经酶活性。总蛋白含量以肉桂树皮油处理最高（38.36 μg/ml），其次为百里香油（35.25 μg/ml）。EST活性以百里香油处理最高（0.28 U/mg），其次为肉桂树皮油（0.19 U/mg）；AChE活性以肉桂树皮油处理最高（0.44 U/mg），其次为百里香油（0.31 U/mg）；GST活性以百里香油处理最高（0.61 U/mg），其次为肉桂树皮油（0.21 U/mg）。方差分析显示各处理间差异显著（F=2.33，df=16, 26，p=0.001）。

**分子对接结果**：由于棕榈蓟马AChE无实验解析结构，以西方花蓟马AChE为替代靶标进行同源建模。拉氏图显示17个残基位于不允许区域，ProSA-web Z-score为-8.23，表明模型整体折叠可靠。对接结果显示，肉桂树皮油中2-甲基二十四烷（2-methyltetracosane, ΔG=-75.09 kJ/mol, Ki 0.000007–0.001 nM）亲和力最高；百里香油中诱虫十三烯（muscalure, ΔG=-66.14 kJ/mol, Ki 0.000259–0.02 nM）、新植二烯（neophytadiene, ΔG=-63.36 kJ/mol）和油醇乙酸酯（oleyl acetate, ΔG=-60.29 kJ/mol）为主要活性成分。百里香酚、α-蒎烯、对伞花烃和桉叶油醇等单体成分主要通过疏水相互作用、π-烷基相互作用与催化 gorge 中的芳香族和脂肪族残基（Phe、Trp、Leu、Val、Ala）结合，桉叶油醇额外与Thr292形成氢键。配体效率（LE）值随分子量增加而降低，亲脂配体效率（LLE）以中等亲脂性单萜最高。

**AChE抑制试验**：剂量-反应抑制曲线显示，肉桂树皮油IC₅₀为0.091 μl/ml，Hill斜率为4.48，表明存在强协同结合效应，能快速达到接近最大抑制水平（约8%）；百里香油IC₅₀为1.48 μl/ml，Hill斜率为1.65，抑制曲线较为平缓，在测试浓度范围内仅产生边际抑制（<2%）。两者95%置信区间均较宽，反映低剂量反应的变异性，但整体趋势一致。

**讨论部分总结**：研究人员指出，合成杀虫剂的过度使用导致神经毒性、致癌性、致畸性和致突变性等健康风险，以及全球数十亿美元的农业损失，因此植物源农药的开发正当其时。肉桂树皮油因最低的LC₅₀值（0.84 μl/ml）而最为有效，其杀虫活性归因于α-蒎烯、α-侧柏烯、β-蒎烯、芳樟醇、对伞花烃和Z-3-十七碳烯等成分的共同作用，这些成分在先前研究中已证实对米象（Sitophilus oryzae）、赤拟谷盗（Tribolium castaneum）和玉米象（Sitophilus zeamais）等害虫具有杀虫活性。

解毒酶作为主要防御机制，其活性变化反映了害虫对植物源杀虫剂的代谢适应。GST通过增强亲电化合物的结合与外排降低毒性，酯酶则水解含酯植物化学物。精油诱导了EST和GST活性的显著升高，同时AChE活性也发生变化，表明精油干扰了解毒途径和神经功能。值得注意的是，不同精油成分对酯酶的调节方向并不一致：罗勒（O. basilicum）、左薄荷醇、α-蒎烯和α-水芹烯等可降低酯酶活性，而胡椒薄荷（M. piperita）和4-蒈烯则增强其活性，说明化学性质决定了酶调节方向。

分子对接结果突显了基于油源、化合物类别和靶标物种的AChE抑制潜力差异。棕榈蓟马AChE偏好高亲脂性（LogP>6）的长链烃和酯类，如2-甲基二十四烷和油醇乙酸酯，这些分子可能通过催化gorge中的广泛疏水相互作用稳定配体-酶复合物。以毒扁豆碱（physostigmine/eserine，Ki=9.27–101.13 nM, ΔG=-52.4 kJ/mol）为参照，2-甲基二十四烷表现出更强预测亲和力，11-十六碳炔-1-醇接近参照水平。但需注意，毒扁豆碱通过经典氨基甲酸酯机制抑制AChE，而精油成分主要为萜类、烃类、醇类、醛类和酯类，其预测结合更可能由催化gorge中的疏水容纳和非共价稳定驱动，应视为推测性非共价AChE结合剂。

对接配体主要由疏水、π-烷基和范德华相互作用稳定，桉叶油醇额外与Thr292/Glu234区域残基产生极性接触。这种非共价gorge占据机制可限制乙酰硫代胆碱进入或改变催化环境局部构型，导致胆碱能信号传导受损、神经肌肉功能障碍和死亡，与观察到的AChE抑制和生物测定毒性一致，尤其针对肉桂树皮油。

配体效率值随分子量增加而下降，表明较大疏水化合物虽可获得高亲和力，但每原子结合贡献较低。高亲脂配体效率值以中等亲脂性单萜最高，支持极端亲脂性导致非特异性结合的原则。数据提示长链疏水酯/烃类可用于蓟马防治，但需通过体外酶抑制试验和体内生物测定进行实验验证，并评估酚类与富烃油组合时的协同效应。

AChE抑制数据明确显示肉桂树皮油优于百里香油：16倍低的IC₅₀、陡峭的Hill斜率（4.48）表明存在高度活性成分和协同结合效应；而百里香油抑制较弱，与其主要成分百里香酚和香芹酚的胆碱酯酶抑制能力较弱相符。从害虫治理角度，肉桂树皮油是更理想的植物源AChE抑制剂，但最大抑制仅约8%，提示其单独使用效果有限，更适合与其他精油或生物杀虫剂配伍。百里香油虽抑制较弱，但因其已知的驱避和抗真菌效应仍可能在组合策略中发挥作用。

研究人员也承认研究存在局限：由于酶抑制试验使用复杂精油混合物而非纯化化合物，未对单一配体对接评分与全油IC₅₀值进行正式回归分析，且静态建模未能充分考虑蛋白质柔性、诱导契合效应、显式溶剂相互作用、配体驻留时间和催化gorge构象动态。精油作为复杂混合物，其生物活性可能受成分间加和、协同或拮抗作用影响。未来研究应采用分子动力学模拟、MM/PBSA或MM/GBSA结合能精修以及纯化AChE抑制试验进一步验证机制。

**研究结论**：本研究表明，肉桂树皮精油和百里香精油对棕榈蓟马具有显著杀虫活性，主要归因于α-蒎烯、对伞花烃、百里香酚、香叶醇和桉叶油醇等生物活性成分。精油暴露诱导酯酶（EST）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和乙酰胆碱酯酶（AChE）活性增强，既反映了害虫的代谢适应，也证实精油对解毒途径和神经通路的干扰作用。尤为重要的是，肉桂树皮油表现出最强的AChE抑制活性，这归因于肉桂醛及相关神经毒性化合物的作用。分子对接研究进一步支持这些成分作为环境友好型植物源农药先导分子的潜力。