新发1型糖尿病（Type 1 Diabetes, T1D）患者外周血循环固有淋巴样细胞（Innate Lymphoid Cells, ILCs）的改变

《Clinical & Translational Immunology》：Alterations of circulating innate lymphoid cells in recent-onset type 1 diabetes

　　

摘要（Abstract） 目的（Objectives）：1型糖尿病（T1D）由自身反应性T淋巴细胞驱动，先天免疫区室亦参与其中，但与自身免疫放大相关的早期先天免疫改变尚不完全清楚。研究人员旨在探讨循环固有淋巴样细胞（ILCs）是否参与上述过程。 方法（Methods）：采用全光谱流式细胞术（spectral flow cytometry）分析新发T1D患者（n=12）及年龄匹配健康供体（healthy donors, HD）的外周血循环ILCs，并对分选纯化的ILC祖细胞（ILC progenitors, ILCP）进行靶向基因表达谱分析。体外评估代谢及炎症因子对ILC活化的调控，功能性评价其对自体记忆CD4+T细胞的抗原呈递能力。在非肥胖糖尿病（Non-Obese Diabetic, NOD）小鼠中验证发现于疾病进展过程中的相关性。 结果（Results）：两组总ILC频率无差异；但T1D患者的ILC1及ILCP显示活化标志物（CD69、HLA-DR）上调，ILCP迁移相关基因（CCR7、CCR6）及调节相关基因（ICOS、CD58）表达降低。糖酵解抑制选择性减弱ILCP活化，提示代谢参与调控。IL-1β（次要程度为IFNγ）增强人循环ILCs抗原呈递相关表型；炎症预激活后，加载胰岛素肽的循环ILCs上调MHC II类分子相关标志物并能诱导抗原特异性自体CD4+记忆T细胞活化。NOD小鼠在糖尿病进展过程中重现了ILC活化及MHC II类分子表达模式。 结论（Conclusion）：新发T1D患者循环ILCs呈预活化、代谢调控表型并具有功能性抗原呈递能力，支持其在自身免疫放大中的潜在作用。本探索性研究结果为了解新发T1D相关先天免疫失调提供了转化医学依据。

本研究发表于《Clinical & Translational Immunology》（CTI）。

论文解读

研究背景与立项依据

1型糖尿病（Type 1 Diabetes, T1D）是由β细胞特异性自身反应性淋巴细胞介导的器官特异性自身免疫病，其确切启动机制尚未完全阐明。除适应性免疫外，先天免疫事件在T1D各阶段的作用逐渐被关注。固有淋巴样细胞（Innate Lymphoid Cells, ILCs）是近年发现的缺乏T/B细胞受体（TCR/BCR）、通过细胞因子及微环境信号快速活化的淋巴样细胞，分为ILC1、ILC2、ILC3亚群及具多向分化潜能的ILC祖细胞（ILC progenitors, ILCP）。生理状态下肠道ILC3可通过产生IL-22保护β细胞或经MHC II类（Major Histocompatibility Complex class II, MHC-II）分子维持调节性T细胞（Regulatory T cells, Tregs），但在炎症环境中ILCs可能获得非经典抗原呈递细胞（Antigen-Presenting Cells, APCs）功能并促进自身免疫。既往报道T1D患者肠道ILC1积聚、ILC3减少，但外周血循环ILCs在新发T1D中是否存在功能性改变及能否放大自身免疫反应尚不明确。本研究据此探讨新发T1D患者循环ILCs的表型、活化状态及抗原呈递潜能。

主要关键技术方法

研究人员纳入确诊2年内新发T1D成人患者（n=12）及年龄匹配健康供体（Healthy Donors, HD；n=23）外周血样本，密度梯度分离冻存外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC）。采用全光谱流式细胞术（Spectral Flow Cytometry）进行循环ILCs（Lin^?CD127⁺）及其亚群（ILC1: CD294^?CD117^?、ILC2: CD294⁺、ILCP: CD294^?CD117⁺）免疫表型分析。磁分选结合荧光激活细胞分选（Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS）纯化ILCP，行实时定量PCR（Quantitative Reverse Transcription PCR, qRT-PCR）检测CCR7、CCR6、ICOS、CD58、HLA-DRA等基因表达。体外用IL-1β、IFNγ、IFNβ刺激纯化ILCs评估抗原呈递分子上调；用糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖（2-Deoxy-D-Glucose, 2-DG）评估代谢依赖。建立自体共培养体系，将IL-1β预激活并加载胰岛素B链9–23肽（InsB_9-23）的ILCs与自体记忆CD4⁺T细胞共孵育，检测T细胞活化（OX40⁺CD25⁺）。采用非肥胖糖尿病（Non-Obese Diabetic, NOD）雌鼠，取5周（未发病）、10周（胰岛炎期）及临床发病期脾脏及胰腺引流淋巴结（pancreatic lymph node, pLN）ILCs，分析MHC-II及CD44表达以跨物种验证。

研究结果

Circulating ILCs from recent-onset T1D patients exhibit a distinct activation profile dominated by ILC1 and ILCP activation features

总循环ILC在CD45⁺白细胞中占比T1D组与HD组相当，但T1D患者循环ILC1比例轻度显著降低。T1D组总体ILCs及选择性地ILC1、ILCP的活化标志物CD69与HLA-DR阳性率显著升高（ILC2无此变化），且ILC1与ILCP间HLA-DR表达呈正相关（r=0.7531, P=0.0063），该相关性仅见于T1D组，提示疾病相关的协同活化。

Transcriptional profiling confirms activation profile and reveals migration defects and reduced regulatory potential in circulating ILCPs from patients with T1D

分选ILCP行qPCR显示T1D组CCR7显著下调、CCR6趋势下降，提示归巢至二级淋巴器官能力受损；共刺激/调节相关分子ICOS与CD58显著下调；HLA-DRA转录本呈上调趋势，与流式表型吻合。表明T1D患者ILCP偏离经典耐受/组织归巢程序，趋向促炎、滞留血循环表型。

ILCP activation is driven by glycolytic metabolism and enhanced under conditions mimicking inflammation

HLA-DR⁺ILC频率与糖化血红蛋白（HbA1c）呈正相关趋势。体外ILC极化培养加糖酵解抑制剂2-DG可选择性抑制ILCP（非ILC1）的CD69与HLA-DR上调，证明ILCP活化依赖糖酵解。此外PHA刺激下T1D来源ILCs较HD更易上调CD69、CD25、HLA-DR及CD80。

IL-1β induces antigen-presentation features in human circulating ILCs

健康人纯化ILCs经IL-1β（10 ng/mL，5天）处理显著上调HLA-DR及共刺激分子CD80，IFNγ作用较弱，IFNβ无明显影响。血浆细胞因子水平组间无显著差异且与ILC活化无相关性，不支持循环细胞因子单独驱动，提示局部炎症（如胰岛IL-1β）可能为组织/细胞内在重编程因素。

Circulating ILCs from T1D patients loaded with islet self-peptides activate insulin-specific autoreactive CD4⁺T cells

IL-1β预激活并加载InsB_9-23肽的自体循环ILCs，与自体记忆CD4⁺T细胞共培养后，T1D患者（n=3）中OX40⁺CD25⁺双阳性T细胞比例显著升高，HD无此现象，证实新发T1D循环ILCs具备呈递胰岛自身抗原并激活自身反应性CD4⁺T细胞的功能。

ILC activation patterns are conserved in the NOD mouse model of autoimmune diabetes

NOD小鼠发病期脾脏ILCs MHC-II⁺频率及平均荧光强度（Mean Fluorescence Intensity, MFI）高于未发病期，CD44（活化标志）亦上调；胰腺淋巴结呈相同趋势。人循环ILC与鼠脾ILC在活化及MHC-II表达上的保守改变支持其生物学相关性。

讨论与结论总结

研究人员发现新发T1D患者循环ILCs——尤其ILCP与ILC1——呈预活化状态：HLA-DR上调、迁移受体CCR7/CCR6下调、调节分子ICOS/CD58降低、糖酵解依赖的活化增强，且在炎症因子（IL-1β）诱导下可获得非经典APC表型，加载胰岛素肽后能激活自体胰岛素特异性记忆CD4⁺T细胞，NOD小鼠重现此活化及MHC-II上调模式。这些特征不同于屏障部位ILCs的耐受功能，提示在T1D系统性炎症与高血糖环境下循环ILCs可能发生"训练样（trained-like）"重编程，从耐受/归巢偏向促炎、抗原呈递及自身免疫放大。研究局限性包括样本量较小、横断面设计无法区分因果、未在全疾病分期验证。结论：新发T1D循环ILCs表现为代谢调控的预活化表型并具功能性抗原呈递能力，可能在自身免疫放大中发挥作用，是T1D潜在的新干预靶标。