系统性STING激动剂脂质体靶向交叉呈递树突状细胞以控制低免疫原性肿瘤

《Clinical & Translational Immunology》：Control of poorly immunogenic tumors with systemic STING agonist-loaded liposomes targeting cross-presenting dendritic cells

　　

癌症疫苗通过联合肿瘤抗原与佐剂以驱动抗肿瘤免疫应答。靶向Clec9A的纳米颗粒将CD4和CD8新表位导向交叉呈递树突状细胞（cross-presenting dendritic cells, DCs），可在无额外佐剂的情况下刺激具有治疗效果的肿瘤特异性免疫。然而，个性化新表位的使用限制了Clec9A纳米颗粒在临床转化中的可扩展性。鉴于Clec9A⁺ DCs在肿瘤中组成性呈递相关新表位但在肿瘤微环境中受到抑制，研究人员开发了靶向Clec9A的STING或RIG-I脂质体以增强内源性肿瘤免疫。研究人员在体内优化了封装RIG-I或STING激动剂MSA-1并以Clec9A结合肽WH修饰的脂质体，用于Clec9A⁺常规DCs和浆细胞样DCs的摄取。通过活体成像确定静脉注射后的生物分布，通过流式细胞术检测细胞摄取与活化。采用ELISA检测血浆中I型干扰素（IFN），并利用Nanostring分析肝脏、脾脏、肿瘤、血液、肾脏、心脏及肿瘤引流淋巴结的转录组。在B16黑色素瘤模型中评估对肿瘤生长、存活及肿瘤特异性T细胞的影响。静脉给药的Clec9A靶向脂质体分布于脾脏、肝脏和肿瘤，并被交叉呈递DCs和浆细胞样DCs摄取。与Clec9A-RIG-I脂质体相比，静脉Clec9A-STING脂质体能更有效地产生I型IFN并活化DCs、B细胞和T细胞。静脉Clec9A-STING脂质体刺激血液、肺、肿瘤和引流淋巴结中IFN依赖性转录。静脉Clec9A-STING脂质体或瘤内Clec9A-RIG-I脂质体显著抑制B16-F10黑色素瘤生长，并诱导新表位和survivin特异性CD4⁺和CD8⁺ T细胞应答。Clec9A-STING脂质体是一种可扩展、可转化的肿瘤靶向免疫治疗平台。

I型干扰素（IFN）特别是IFN-α在促进抗原免疫原性呈递和启动有效抗肿瘤应答中发挥关键作用。在树突状细胞（DCs）中，胞质双链DNA（dsDNA）被环状GMP-AMP合成酶（cGAS）识别，催化产生第二信使cGAMP，进而激活干扰素基因刺激因子（STING），触发强效I型IFN产生及下游IFN刺激基因（ISG）的诱导。STING作为位于内质网膜上的信号蛋白，连接胞质DNA识别与先天免疫应答激活。结合cGAMP后，STING发生构象变化并易位至高尔基体，激活TANK结合激酶1（TBK1），进而磷酸化干扰素调节因子3（IRF3），驱动IFN表达。在DCs中，STING信号增强抗原处理和交叉呈递，从而促进CD8⁺ T细胞应答。然而，临床转化受限于肿瘤特异性递送不佳和全身毒性等挑战。MSA-1作为一种非核苷酸STING激动剂，与其类似物MSA-2类似，作为"分子胶"诱导STING二聚化，具有增强的稳定性，并对多种人STING分子变体具有更广泛的效力。MSA-2的效能在肿瘤微环境（TME）酸化条件下增强，皮下给药联合抗PD1在多种抗PD1无应答肿瘤模型中显示抗肿瘤效果。另一方面，MSA-1需要瘤内给药，联合抗PD1在非应答肿瘤模型中有效。5'-三磷酸RNA通过RIG-I激活I型IFN，脂质颗粒聚集体（LPAs）递送肿瘤mRNA可在静脉给药后诱导I型IFN应答和DC活化。交叉呈递的经典I型DCs（cDC1）表达cDC1特异性C型凝集素受体Clec9A，结合其配体F-actin以摄取死亡或焦亡细胞抗原并将其穿梭至交叉呈递途径。研究人员此前证明了Clec9A靶向定制纳米乳剂（TNE）封装蛋白抗原或CD4和CD8表位以刺激治疗性肿瘤特异性免疫的临床前疗效和机制。

研究人员采用微流控系统开发以WH肽修饰并负载STING或RIG-I激动剂的脂质体，WH肽可选择性靶向小鼠Clec9A且无不良免疫效应。确定WH与PEG5000-DSPE脂质体的缀合最优摩尔比为1:2，流速12 mL/min时脂质体具有最优的多分散指数（PDI）、强度、粒径和电荷。基于WH缀合脂质体与脾CD8⁺CD11b^? cDC1和CD8^?CD11b⁺ cDC2体外结合的比值，最优WH-PEG浓度为0.25%，该浓度下WH脂质体在体内结合脾cDC1和pDC的水平与先前报道的WH-TNE相当。在缺乏cDC1的Batf3^?/?小鼠中，WH脂质体不被脾DCs摄取，证实了其特异性。

研究人员封装不同浓度的STING激动剂MSA-1、MSA-2或RIG-I激动剂至WH脂质体中。静脉注射6小时后，MSA-1（26–52 μg/mL）或RIG-I激动剂（28–155 μg/mL）脂质体使cDC1、cDC2、B或T细胞的共刺激/活化标志物表达上调2至15倍；而MSA-2在相似浓度下刺激作用小于2倍。MSA-1脂质体诱导IFN-α和IFN-β的剂量依赖性分泌，RIG-I激动剂诱导较低水平IFN-α且无IFN-β。在TC-1荷瘤小鼠中，瘤内注射和2×浓缩200 μL静脉注射的肿瘤放射效率最高，肺、肝和脾的放射效率呈剂量依赖性增加。MSA-1和RIG-I激动剂均剂量依赖性地活化脾cDC1、cDC2、B和T细胞，且MSA-1活化T细胞CD69的效果优于RIG-I。功能化WH肽增加MSA-1脂质体在肿瘤中的摄取并增强脾免疫细胞活化，低至25 μL WH-MSA-1脂质体即可刺激脾cDC1和cDC2，50 μL即可激活B和T细胞。

Nanostring分析显示，静脉MSA-1或RIG-I WH脂质体在血液、脾、肺、肿瘤引流淋巴结和肿瘤中诱导协调的I型IFN转录特征，包括OAS2、OAS3、OASL、GBP4和IFIT3等基因的下调。肿瘤中ISG剂量反应表明低剂量静脉MSA脂质体即可有效诱导基因表达，与脂质体的靶向作用模式一致；而肿瘤外ISG表达呈剂量依赖性增加，与剂量增加时更大的全身效应一致。

在B16F10黑色素瘤模型中，从肿瘤细胞接种后10天开始每周静脉给予WH-MSA-1脂质体（2× 200 μL）或瘤内给予（50 μL）显著抑制肿瘤生长并改善生存，效果与WH-TNE新表位相当，优于未靶向MSA-1脂质体或瘤内WH-MSA-1脂质体。静脉WH-MSA-1脂质体扩增了针对B16F10新表位和肿瘤相关抗原survivin的多功能CD8⁺ T细胞，以及产生细胞因子的CD4⁺和CD8⁺ T细胞。抗PD1单抗DX-40单独对B16-F10黑色素瘤生长影响甚微，且与静脉WH-MSA-1脂质体联用未进一步抑制生长。相比之下，静脉WH-RIG-I脂质体未能减少肿瘤生长或改善生存，但瘤内WH-RIG-I脂质体抑制肿瘤生长并改善生存，效果与WH-TNE相当，且无局部或全身毒性证据。

靶向方法包括将抗原与Clec9A特异性单克隆抗体缀合，以及用Clec9A特异性WH肽修饰纳米颗粒，已被证明是安全高效的Clec9A靶向工具。研究人员设计的脂质体通过Clec9A靶向将STING或RIG-I激动剂递送至cDC1，具有保护激动剂货物免受酶降解的优势，且Clec9A靶向促进激动剂向胞质内递送，而STING正位于胞质。I型IFN特征在血液、肺、肿瘤和肿瘤引流淋巴结中的广泛表达，与上调ISG以活化抗原呈递细胞并趋化激活的T细胞、NK细胞和单核细胞至肿瘤相关。静脉Clec9A-STING脂质体和瘤内Clec9A-RIG-I脂质体均扩增肿瘤抗原特异性多功能CD4和CD8 T细胞并控制肿瘤生长，而瘤内Clec9A-STING脂质体、静脉Clec9A-RIG-I脂质体或单独抗PD-1 mAb效果较差。

静脉给予WH-MSA-1或WH-RIG-I脂质体后，血浆中IFN-α的诱导与I型IFN特征一致。pDC摄取WH脂质体后产生大量IFN-α，WH-MSA-1或RIG-I脂质体类似外泌体的特性使其将激动剂细胞内递送以激活cGAS-STING或RIG-I，导致全身IFN介导的细胞活化。在肿瘤免疫治疗环境中，WH-MSA-1和RIG-I脂质体扩增了survivin和新表位特异性CD4⁺和CD8⁺ T细胞，表明多种旁立肿瘤表位被呈递以参与适应性免疫。

尽管新抗原识别因大规模并行测序技术的进步变得可行且经济，但及时配制和免疫原性递送新表位以进行有效癌症疫苗接种仍面临重大挑战。通过利用纳米颗粒策略靶向Clec9A⁺ DC1和pDC以分别激活其原位处理肿瘤抗原的呈递能力和I型IFN产生，研究表明"冷"肿瘤可被快速激活为"热"环境，在肿瘤特异性免疫治疗之前启动抗肿瘤免疫应答并抑制肿瘤生长。研究人员创建的Clec9A脂质体制剂使用半合成脂质、PEG和WH靶向肽，具有已确立的临床追踪记录，采用微流控技术具有快速实验室优化、高度过程控制和可重复性以及相对易于规模化生产用于产品制造的优势。

**研究结论**

Clec9A-STING脂质体通过I型IFN诱导、DC抗原交叉呈递和多功能肿瘤特异性CD4⁺和CD8⁺ T细胞扩增增强肿瘤抗原免疫原性。它们可规模化生产并经静脉给药，避免了瘤内给药，在低免疫原性B16F10皮肤黑色素瘤临床前模型中具有强效疗效。Clec9A-STING脂质体代表了一种适用于低免疫原性癌症的多功能、可转化免疫治疗策略。