基于多组学解析肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）预后相关T细胞亚群的研究

《Clinical and Translational Medicine》：Multi-omics insights for deciphering prognosis-related T cell subsets in hepatocellular carcinoma

　　

背景：肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是导致肿瘤相关死亡的主要病因之一。T细胞与细胞因子在肿瘤进展中发挥关键作用，但与HCC预后相关的T细胞全景图谱尚未明确。方法：研究人员利用质谱流式（mass cytometry, CyTOF）、批量RNA测序（bulk RNA sequencing）和单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据结合生存信息，分析了瘤内免疫细胞、趋化因子和细胞因子的预后意义。研究人员通过scRNA-seq构建了CD4+CD8+双阳性T细胞（double positive T cells, DPT）特征，采用单样本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis, ssGSEA）评分进行量化，并评估其与阿替利珠单抗（atezolizumab）联合贝伐珠单抗（bevacizumab）治疗应答的关系。研究人员通过scRNA-seq和空间转录组学分析了细胞互作与空间模式。研究人员通过流式细胞术、基因敲减、Transwell迁移、共培养、逆转录定量PCR（reverse transcription quantitative PCR, qPCR）和伤口愈合实验进一步验证DPT相关微环境（niche）。发现：瘤内较高水平的DPT细胞、CD45RA+CD4+常规T细胞、HBEGF（heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor）和CX3CR1与HCC不良预后相关；相反，CD161+CD45RA?CD4+常规T细胞和CD8+T细胞浸润较高与生存期延长相关。CD45+EpCAM+和CD45+α-SMA+细胞在短期生存者中更常见。DPT浸润在HCC多个队列和同源小鼠模型中均被鉴定到。在接受阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗的患者中，应答者的DPT ssGSEA评分高于非应答者。多组学分析表明DPT细胞与毛细血管相关内皮细胞（endothelial cells, ECs）存在互作和空间关联，支持其构成促肿瘤微环境。HBEGF与DPT细胞呈正相关并在内皮区室高表达。内皮源HBEGF敲减减少了DPT迁移。此外，DPT共培养提高了Hep3B细胞中免疫抑制检查点、趋化因子信号、上皮-间质转化（epithelial–mesenchymal transition, EMT）和干性相关特征的表达并促进其迁移。结论：研究人员通过鉴定不同的T细胞群体和分子互作描绘了HCC的预后免疫全景。DPT细胞是不良预后的关键生物标志物，内皮源HBEGF–DPT轴可能是一个潜在治疗靶点。

研究背景：肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是最常见的原发性肝癌类型，早期手术复发率高，中晚期系统治疗效果有限，总体5年生存率低于20%。肿瘤微环境（tumour microenvironment, TME）中免疫细胞亚群的异质性与预后、治疗应答密切相关，但HCC中与预后相关的T细胞全景图谱尚未明确，尤其缺乏基于高分辨率单细胞技术并结合多组学整合的系统性研究。为此，研究人员开展多组学整合研究，旨在解析HCC预后相关的T细胞亚群及其分子互作机制，并探索潜在生物标志物与治疗靶点。论文发表在《Clinical and Translational Medicine》。

主要关键技术方法：研究人员采用以下关键技术与样本来源：质谱流式（CyTOF）分析湘雅队列（Xiangya cohort，新鲜HCC组织n=16，配对癌旁7例）和复旦–华山队列（Fudan–Huashan cohort，n=35）的免疫细胞图谱；批量RNA测序（bulk RNA-seq）对应上述队列的肿瘤组织；公共scRNA-seq数据集（PRJCA007744，n=60例HCC患者，含9例配对外周血、肿瘤、癌旁）用于单细胞注释与亚群分析；公共批量转录组队列包括TCGA-LIHC（n=368）、ICGC-LIRI-JP（n=232）、CHCC-HBV中国乙肝相关HCC队列（n=159）用于生存验证；阿替利珠单抗（atezolizumab）联合贝伐珠单抗（bevacizumab）治疗队列来自GO30140和IMbrave150试验合并校正后n=247例；空间转录组（stereo-seq，CNP0004497，2例HCC患者bin100分辨率）分析细胞空间关系；构建原位同基因HCC小鼠模型（H22细胞系注射BALB/c小鼠）与自发HCC模型（C57BL/6小鼠DEN+CCl₄诱导）验证DPT存在；多重免疫组化（multiplexed immunochemistry, mIHC）与流式细胞术用于表型与分选验证；细胞互作推断采用CellChat，富集分析用GSVA（ssGSEA）、KEGG等；功能实验包括内皮细胞HBEGF siRNA敲减、Transwell迁移、DPT与Hep3B非接触共培养、qPCR检测免疫/EMT/干性基因、伤口愈合实验。

结果：

3.1 肝细胞癌（HCC）的肿瘤免疫全景：研究人员通过对湘雅队列和复旦–华山队列的批量RNA-seq计算ESTIMATE评分（TumorPurity、StromalScore、ImmuneScore），发现长短生存期组间无显著差异，说明批量水平免疫/基质比例不足以解释预后差异。随后用CyTOF解析CD45⁺免疫细胞分为14群，t-SNE可视化显示肿瘤与癌旁免疫组成异质性：肿瘤中总CD4⁺T细胞占CD45⁺比例升高，总CD8⁺T细胞比例下降，但长短生存组间总CD4⁺、总CD8⁺比例无显著差异。

3.2 瘤内浸润DPT细胞是HCC不良预后指标并表达耗相关免疫标志物：研究人员发现短期生存者肿瘤及癌旁中CD4⁺CD8⁺双阳性T细胞（DPT）占CD45⁺及活细胞比例均显著高于长期生存者。mIHC与多个独立队列验证DPT频率与短生存相关。单变量与多变量Cox比例风险回归及Kaplan–Meier分析显示DPT是危险因子（HR>2，p<0.01）。FlowSOM聚类将DPT分为naive（CD45RA⁺PD-1^?TIM-3^?LAG-3^?）、activated（CD45RO⁺IFNG⁺）、exhausted（PD-1⁺TIM-3⁺LAG-3⁺CD45RA^?）三种状态，mIHC可见PD-1^brightCTLA4^dim与PD-1^dimCTLA4^brightDPT。

3.3 DPT细胞有组织偏好和微环境（niche）偏好，与毛细血管相关内皮细胞（ECs）及M2巨噬细胞互作：scRNA-seq数据显示DPT在血液中丰度最高，但短期生存者中DPT组织趋向性强于长期生存者，且DPT在短期生存者肿瘤中富集。DPT特征基因富集免疫检查点通路。外部队列（TCGA-LIHC、ICGC、CHCC）中高DPT ssGSEA评分关联不良预后；阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗队列中高DPT评分对应更好治疗应答。CellChat分析显示短期生存者DPT接收更强来自M2巨噬细胞、单核细胞、上皮细胞、毛细血管ECs的 incoming信号，发出更强信号给CD56^dimNK、M2、单核细胞、毛细血管ECs。空间转录组显示DPT评分在毛细血管EC-high区和M2巨噬细胞-high区及其邻域更高，支持共定位。DPT进一步分naive（血富集、长生存倾向）、activated、exhausted（组织富集、短生存倾向）；拟时序分析支持naive→activated→exhausted轨迹。

3.4 瘤内CD8⁺T细胞频率降低与短生存相关：CyTOF分析显示短期生存者肿瘤CD8⁺T占CD45⁺比例更低，生存分析与Cox模型确认CD8⁺T是保护因子（独立预后）。CD8⁺T按CD45RA/CD45RO分为四亚群：CD45RA^?CD45RO⁺（记忆）和CD45RA^?CD45RO^?在短生存肿瘤中显著更低且与保护预后相关；记忆CD8⁺T按CD161、CD57、PD-1、CD28细分六亚群，总记忆量而非单一亚群主导预后价值。

3.5 瘤内CD45RA⁺CD4⁺常规T细胞（Tconv）富集于短生存者且预后不良，而CD45RA^?CD4⁺Tconv相反：CyTOF显示短生存者肿瘤CD45RA⁺CD4⁺Tconv频率更高，CD45RA^?CD4⁺Tconv更低，二者比例负相关。生存与Cox模型确认CD45RA⁺CD4⁺Tconv为危险因子、CD45RA^?CD4⁺Tconv为保护因子（独立预后）。CD45RA^?CD4⁺Tconv按CD161/CD57/PD-1/CD28细分后仅CD161⁺CD45RA^?CD4⁺Tconv具显著保护意义，该群高表达KLRB1，表型似黏膜相关恒定T细胞（mucosal-associated invariant T cells, MAIT）。

3.5 HBEGF是HCC潜在危险因子：批量RNA-seq差异分析与单变量Cox回归交集细胞因子/趋化因子/受体基因集，筛选出HBEGF、CX3CR1、FGF14为候选风险分子。湘雅、复旦队列及多变量Cox验证HBEGF、CX3CR1、FGF14高表达关联短生存；跨TCGA、ICGC、CHCC验证HBEGF、CX3CR1为风险因子（FGF14未一致）。scRNA-seq中HBEGF主要表达于内皮（毛细血管EC、动脉EC）、M2巨噬细胞、单核细胞；CX3CR1富集于GZMB⁺CD8⁺T、CD56^dimNK。HBEGF与DPT比例正相关（湘雅、复旦），CX3CR1仅湘雅正相关；DPT相对高表达HBEGF受体EGFR、ERBB4及CX3CR1配体CX3CL1。

3.6 CD45⁺EpCAM⁺与CD45⁺α-SMA⁺细胞群在短生存者肿瘤中频率更高且是HCC危险因子：FlowSOM全细胞聚为36簇，Cluster14（CD45⁺α-SMA⁺）和Cluster34（CD45⁺α-SMA⁺EpCAM⁺）在短生存肿瘤显著更高。mIHC证实肿瘤存在α-SMA⁺CD45⁺及EpCAM⁺CD45⁺细胞。scRNA-seq中apCAF（抗原提呈癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs），似Cluster14）富集免疫检查点通路，apCAF评分在ICGC、CHCC关联不良预后；Epithelial_C8（似Cluster34）富集PPAR信号，其评分在TCGA、ICGC、CHCC均关联不良预后；两签名与阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗应答无显著关联。

3.7 内皮源HBEGF促进DPT迁移，DPT共培养诱导肿瘤细胞促肿瘤转录改变与迁移：流式显示患者外周血与肿瘤均有DPT，PD-1⁺比例DPT高于CD8⁺T。内皮细胞AW-CCH599敲减HBEGF（si-HBEGF #1）后，Transwell体系下迁移至下室的DPT数量显著减少。非接触共培养DPT与Hep3B细胞后，qPCR显示Hep3B中免疫抑制基因（CD155、CCL5、CCL22、CD274）、EMT基因（CDH2、VIM、SNAIL1、SLUG）、干性基因（CD44、OCT4、CD133）上调；伤口愈合实验显示Hep3B迁移增强（24、48、72 h闭合率更高）。

讨论总结：研究人员指出TME在HCC预后异质性中起关键作用，通过整合CyTOF（湘雅n=16，复旦–华山n=35）、scRNA-seq、批量RNA-seq等多组学数据，在单细胞分辨率下刻画了预后相关细胞特征，鉴定出非常规群体如DPT细胞、CD45⁺EpCAM⁺、CD45⁺α-SMA⁺在独立队列一致存在。多组学富集、细胞互作（CellChat）、空间转录组（stereo-seq）解析了DPT功能属性与空间组织：DPT分naive、activated、exhausted三种状态，exhausted DPT在短生存者肿瘤富集；DPT与毛细血管ECs、M2巨噬细胞双向强互作且空间共定位；阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗队列中高DPT评分关联更好应答，提示DPT可作为治疗应答潜在标志物。功能实验初步支持内皮HBEGF促进DPT迁移，DPT共培养促Hep3B免疫抑制/EMT/干性基因上调与迁移增强，但属体外初步证据，尚不能完全确立体内因果轴。HBEGF、CX3CR1为批量RNA筛选的风险分子：HBEGF在内皮/髓系高表达、与DPT比例正相关、敲减减少DPT迁移；CX3CR1在GZMB⁺CD8⁺T、CD56^dimNK高表达，配体CX3CL1相对富集于DPT，但CX3CR1功能仅 correlative。CD45RA⁺CD4⁺Tconv（naive样，低效应）在短生存肿瘤富集提示免疫微环境偏未分化/失活T细胞、抗肿瘤免疫不足；CD45RA^?CD4⁺Tconv尤其是CD161⁺亚群具保护性，表型似MAIT，其功能语境依赖性复杂。Cluster14（CD45⁺α-SMA⁺）转录似apCAF，富集免疫检查点通路，评分关联不良预后；Cluster34（CD45⁺EpCAM⁺）似Epithelial_C8，富集PPAR信号，评分一致关联不良预后；此类双重表型细胞可能源于吞噬囊泡或细胞融合，机制待阐明。局限性：CyTOF发现队列样本量偏小；功能性实验主要体外且患者来源DPT有限；HBEGF仅部分验证，CX3CR1未功能验证；部分公共队列缺肝功能/AFP/血管侵犯等协变量，多变量调整受限；免疫治疗分析基于预处理转录本合并批次校正后有残留异质可能。结论：研究人员通过多组学整合描绘HCC TME预后相关免疫亚群与分子特征，瘤内DPT在多队列一致关联不良预后，内皮HBEGF–DPT轴初步证据支持其促肿瘤作用，DPT可作为候选预后 biomarker，该niche值得在抗血管生成联合免疫治疗背景下进一步研究。