《Clinical and Translational Medicine》：Single-cell profiling reveals peripheral blood immune landscape remodelling in breast cancer lymph node metastasis
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背景：腋窝淋巴结(Lymph Node, LN)转移显著影响乳腺癌(Breast Cancer, BC)预后，系统性免疫微环境在促进转移中的作用尚不清楚。目的：本研究描述BC患者LN转移相关的外周血免疫改变。方法：对6例LN转移阳性(Pos)和阴性(Neg)B
背景：腋窝淋巴结(Lymph Node, LN)转移显著影响乳腺癌(Breast Cancer, BC)预后，系统性免疫微环境在促进转移中的作用尚不清楚。目的：本研究描述BC患者LN转移相关的外周血免疫改变。方法：对6例LN转移阳性(Pos)和阴性(Neg)BC患者的外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC)进行单细胞RNA测序/scT细胞受体(T-cell Receptor, TCR)测序(scRNA-seq/scTCR-seq)，并通过体外功能实验及额外14例BC组织单细胞数据验证。结果：scRNA-seq鉴定Pos组富集促转移免疫亚群——表达干扰素刺激基因(Interferon-Stimulated Gene, ISG)的中性粒细胞neutrophil_RSAD2、表达促血管生成因子的中性粒细胞neutrophil_MMP9、免疫抑制性CD4+Treg_FOXP3及细胞毒性耗竭T/NK细胞(CD8+Teff_GZMH和NKT_GNLY)；Neg组富集抗转移CD8+Teff_CCL5。Pos组显示表达细胞毒性标志物GZMH/GNLY的大克隆扩增T细胞。通过中性粒细胞/单核吞噬细胞(Mononuclear Phagocyte, MP)—MP/TandNK轴，Pos组LGALS9?HAVCR2检查点互作升高，与免疫抑制微环境及转移状态相关。上述促/抗转移免疫特征及LGALS9?HAVCR2轴经体外实验证实并在BC组织中一致观察到。功能共培养实验确立因果关系：干扰素刺激的中性粒细胞分泌LGALS9损害T细胞细胞毒性功能；中和LGALS9或阻断该轴可恢复T细胞介导的肿瘤细胞杀伤。结论：LN转移伴随系统性免疫重塑，富集免疫抑制性中性粒细胞及T/NK细胞并激活LGALS9?HAVCR2信号。这些发现揭示了与LN转移状态相关的免疫特征，并鉴定出值得进一步验证的候选生物标志物及治疗靶点。
论文解读：《Single-cell profiling reveals peripheral blood immune landscape remodelling in breast cancer lymph node metastasis》（发表于Clinical and Translational Medicine）
研究背景与立项依据
腋窝淋巴结(Lymph Node, LN)转移是乳腺癌(Breast Cancer, BC)重要的预后因素，影响分期、治疗决策及生存率。肿瘤微环境(Tumour Microenvironment, TME)通过细胞表面蛋白及配体?受体(Ligand?Receptor, L?R)互作调控癌变与进展，肿瘤引流淋巴结(Tumour-Draining Lymph Nodes, TDLNs)作为连接局部转移与系统性免疫的关键中继站，其内癌细胞可重塑局部免疫并再次入血调节外周血免疫谱。既往研究多聚焦于原发灶或转移灶局部TME，外周血作为免疫细胞循环池在BC免疫逃逸中的作用尚不清楚。外周血免疫细胞动态变化可无创反映肿瘤免疫状态及转移潜能，研究人员假设LN转移会诱导外周血免疫谱系统性重塑，表现为富集表达干扰素刺激基因(Interferon-Stimulated Gene, ISG)的免疫抑制中性粒细胞亚群、积聚细胞毒性耗竭T/NK细胞，以及激活LGALS9（编码Galectin-9）?HAVCR2（编码TIM-3）检查点轴驱动T细胞耗竭，从而促进免疫许可微环境形成，故开展此项研究。
主要技术方法与研究对象
研究人员纳入浸润性Luminal B亚型BC患者：3例LN转移阳性(Pos)和3例阴性(Neg)行外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC)的单细胞RNA测序(scRNA-seq)及scT细胞受体(T-cell Receptor, TCR)测序(scTCR-seq)；另收集7例Pos和7例Neg的BC组织进行scRNA-seq验证。PBMC分离后经Celescope处理生成表达矩阵，DecontX去除环境RNA污染，Scrublet去除双细胞，Harmony校正批次效应，Scanpy聚类注释细胞类型，Monocle 2做拟时序(Pseudo-time)轨迹分析，CellPhoneDB预测细胞?细胞互作，UCell计算基因集评分，Ro/e比(观察数/期望数)量化细胞富集，并采用HL-60诱导中性粒细胞样细胞、激活T细胞共培养、Western blot、酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)、流式细胞术及Transwell共培养体系进行体外功能验证。
研究结果
3.1 Cellular profiling of patients' PBMCs（患者PBMC的细胞图谱）
研究人员对Pos与Neg组各3例外周血PBMC进行scRNA-seq，质控后获得47,960个细胞转录组，注释为B细胞、浆细胞、TandNK细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核吞噬细胞(Mononuclear Phagocyte, MP)及血小板。Ro/e分析显示Pos组TandNK细胞、B细胞及MP相对富集而中性粒细胞比例下降，提示外周血细胞组成随LN转移状态发生重编程。
3.2 Neutrophils exhibiting higher ISG signature in Pos group（Pos组中性粒细胞呈现更高ISG特征）
中性粒细胞分6个亚群，neutrophil_RSAD2（高表达ISG）和neutrophil_MMP9（高表达促血管生成因子）在Pos组显著富集。拟时序分析示MMP9出现在分化早期，RSAD2出现在分化晚期；体外HL-60诱导分化时间曲线证实MMP9第3天达峰后下降，RSAD2第3天后上升第5天达峰，提示neutrophil_MMP9参与早期基质重塑，neutrophil_RSAD2为后期LGALS9潜在来源。
3.3 Characteristic TandNK cells in peripheral blood of Pos and Neg groups（Pos与Neg组外周血特征性TandNK细胞）
TandNK细胞分12个亚群，Pos组富集CD4+Treg_FOXP3（高Treg特征）、CD8+Teff_GZMH和NKT_GNLY（高增殖、细胞毒性及耗竭特征）；Neg组富集CD8+Teff_CCL5（高CCR7?CCL5+，参与T细胞招募与免疫监视）。流式细胞术验证Pos组CD3+CD56+GNLY+细胞升高，Neg组CD3+CD8+CD45+CCR7?CCL5+细胞升高。
3.4 Amplification of clonal T cells in peripheral blood of Pos and Neg groups（Pos与Neg组外周血T细胞克隆扩增）
scTCR-seq显示Pos组大克隆（clone size > 10）T细胞比例升高，主要分布于CD8+Teff_GZMH和NKT_GNLY中；大克隆T细胞显著高表达GZMH、GNLY，富集白细胞介导的细胞毒性及MHC蛋白结合通路，符合Pos组细胞毒性耗竭表型。
3.5 Overview of B cells in peripheral blood（外周血B细胞概览）
B细胞分10亚群，SwitchMemoryB及UnSwitchedMemoryB在Pos组富集，NaiveB在Neg组富集。Neg组NaiveB上调通路富集中性粒细胞趋化/迁移，提示可能通过招募天然免疫细胞形成抗瘤微环境。
3.6 LGALS9?HAVCR2 immune checkpoint interaction existing between peripheral blood immune cells in Pos group（Pos组外周血免疫细胞间存在LGALS9?HAVCR2免疫检查点互作）
CellPhoneDB分析显示Pos组MP与中性粒细胞、TandNK细胞及MP内部互作增强，LGALS9?HAVCR2互作对在Pos组显著升高，LGALS9主要高表达于neutrophil_RSAD2（ISG+中性粒细胞）及经典/中间单核细胞，HAVCR2高表达于CD8+Teff_GZMH、NKT_GNLY等耗竭T/NK细胞。体外实验证实I型干扰素(IFN-I)诱导HL-60来源中性粒细胞样细胞高表达RSAD2，在模拟Pos微环境的IL-6和L-乳酸条件下分泌更多LGALS9；过表达LGALS9的中性粒细胞样细胞共培养使激活T细胞丧失抑瘤能力（MCF-7迁移及克隆形成增加），siRNA敲低LGALS9则恢复T细胞肿瘤杀伤功能，证实neutrophil_RSAD2来源LGALS9结合T/NK细胞HAVCR2诱导耗竭及免疫逃逸。
3.7 Tumour tissue results validating the observed immune response in peripheral blood（肿瘤组织结果验证外周血免疫应答）
对14例BC组织scRNA-seq验证，Pos组恶性上皮细胞高表达IL-6、TGFB1及缺氧基因LDHA、HIF1A；组织内MP及TandNK同样显示Pos组LGALS9?HAVCR2互作增强，CD8+效应/耗竭T细胞及NK细胞高细胞毒性?耗竭特征，CD4+Treg高FOXP3，CD8+效应T细胞高CCL5，与外周血发现一致，证实外周血免疫重塑反映局部TME特征。
讨论与结论总结
讨论指出，LN转移阳性BC患者外周血neutrophil_RSAD2经IFN-I刺激分泌LGALS9，通过LGALS9?HAVCR2轴作用于MP及耗竭T/NK细胞致免疫抑制；neutrophil_MMP9通过基质降解及促血管生成助长转移；Pos组CD4+Treg_FOXP3及双阳性（细胞毒性+耗竭）CD8+/NKT细胞富集，Neg组CD8+Teff_CCL5富集发挥抗转移免疫监视。该LGALS9?HAVCR2轴及特征免疫细胞亚群可作为外周血液体活检候选标志物，靶向阻断该轴有望逆转T细胞耗竭。局限性包括样本量小、未行体内验证及缺乏健康对照等，需在更大前瞻性队列中验证。
结论翻译：本研究中，研究人员通过scRNA-seq、scTCR-seq及体外实验分析了伴或不伴LN转移的BC患者PBMC及癌组织中免疫细胞差异，鉴定出促转移与抗转移亚群并追踪形成免疫抑制微环境的关键靶点。本研究增进了对BC伴LN转移患者系统性免疫重塑的理解，并鉴定出经大样本前瞻性验证后有望成为生物标志物的候选免疫特征。
