角质形成细胞与蛋白酶激活受体2（Protease-Activated Receptor 2, PAR2）在继发性淋巴水肿发生发展中的关键作用

《Clinical and Translational Medicine》：Critical role of keratinocytes and protease-activated receptor 2 in secondary lymphedema development

　　

背景：继发性淋巴水肿是肿瘤治疗后常见并发症，表皮过度角化是其组织学标志，但角质形成细胞在该病病理生理中的作用尚不清楚。方法：研究人员评估了乳腺癌相关淋巴水肿（Breast Cancer-Related Lymphedema, BCRL）患者活检标本及小鼠淋巴水肿模型中角化过度、PAR2上调及Th2诱导细胞因子表达情况；采用全局PAR2基因敲除（PAR2 Knockout, PAR2KO）、角质形成细胞特异性PAR2条件性敲除（Keratinocyte-Specific PAR2 Conditional Knockout, PAR2cko）及骨髓嵌合体模型抑制PAR2，或使用局部特立氟米特（Teriflunomide, TF）抑制角质形成细胞增殖，分析小鼠淋巴水肿模型；体外用BCRL患者淋巴液（Lymph Fluid, LF）刺激人角质形成细胞，观察直接效应。结果：BCRL患者活检标本及小鼠模型中角化过度、Th2诱导细胞因子（胸腺基质淋巴细胞生成素 Thymic Stromal Lymphopoietin, TSLP；白细胞介素-33 Interleukin-33, IL-33）及PAR2表达显著升高。角质形成细胞通过产生Th2诱导细胞因子在淋巴水肿发生中起首要作用；淋巴损伤后角质形成细胞增殖及PAR2表达是早期反应，调控Th2诱导细胞因子表达、朗格汉斯细胞（Langerhans Cells, LCs）迁移及Th2分化T细胞皮肤浸润。PAR2缺陷或用小分子抑制剂抑制PAR2激活、或用TF抑制角质形成细胞增殖，均可减少Th2炎症并减轻继发性淋巴水肿；局部TF能有效减轻肿胀、纤维化、炎症及淋巴水肿整体病理改变。结论：淋巴水肿是一种慢性炎症性皮肤病，局部靶向抑制角质形成细胞可能是临床有效治疗手段。关键点：活化的角质形成细胞通过PAR2产生Th2诱导细胞因子调控皮肤Th2炎症反应，在继发性淋巴水肿病理生理中起关键作用。

《Critical role of keratinocytes and protease-activated receptor 2 in secondary lymphedema development》论文解读

一、研究背景与立项依据

继发性淋巴水肿（Secondary Lymphedema）多由癌症手术淋巴结切除引发，现有治疗手段如综合消肿疗法（Complete Decongestive Therapy, CDT）或压力袜仅为姑息对症，无法逆转病程，外科淋巴管重建对晚期患者效果不佳。既往研究证实淋巴水肿组织中存在CD4⁺T细胞依赖的Th2型慢性炎症，且Th2诱导细胞因子（如TSLP、IL-33、IL-25）可促进纤维化与淋巴管功能不全；而临床上淋巴水肿皮肤典型表现为角化过度（Hyperkeratosis）、棘层肥厚等表皮改变，这与特应性皮炎（Atopic Dermatitis, AD）中由活化角质形成细胞（Keratinocytes, KCs）启动Th2炎症的病理模式高度相似。然而，角质形成细胞是否及如何参与继发性淋巴水肿的发生发展此前未见明确报道。基于此，研究人员假设淋巴损伤后角质形成细胞被激活并通过PAR2–Th2诱导细胞因子轴启动皮肤Th2炎症，进而驱动淋巴水肿病理进程，并开展本研究验证该假说。本研究发表于Clinical and Translational Medicine。

二、主要关键技术方法概述

研究人员收集纪念斯隆?凯特琳癌症中心25例单侧上肢Ⅰ–Ⅱ期乳腺癌相关淋巴水肿（BCRL）患者患肢及健侧正常皮肤活检标本与患肢淋巴液（LF），同时建立小鼠尾部皮肤及淋巴管切除淋巴水肿模型。采用全局PAR2基因敲除（PAR2KO）、骨髓移植嵌合体（区分实质细胞与造血细胞PAR2作用）及KRT14Cre^ERT2介导的角质形成细胞特异性PAR2条件性敲除（PAR2^cko）小鼠；局部给予小分子PAR2拮抗剂ENMD-1068、TSLP抑制剂黄芩素（Baicalein）或FDA已批准药物特立氟米特（Teriflunomide, TF，嘧啶合成抑制剂）外用干预；体外用人/小鼠原代角质形成细胞经患者LF或小鼠LF刺激，并用PAR2 siRNA敲低或抑制剂处理；检测手段包括苏木精?伊红（H&E）染色与免疫荧光（Immunofluorescence, IF）、实时荧光定量PCR（qPCR）、蛋白质印迹（Western Blot, WB）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、 bulk RNA测序（RNA Sequencing, RNA?seq）、单细胞RNA测序（scRNA?seq）、流式细胞术及淋巴液液相色谱?串联质谱（LC?MS/MS）蛋白组学分析。

三、研究结果

2.1 淋巴水肿导致角化过度、表皮细胞去分化、Th2诱导细胞因子表达增加及角质形成细胞PAR2状态依赖性表达

研究人员对BCRL患者健侧与患侧皮肤比对发现，患侧表皮面积增大，Ki67⁺增殖角质形成细胞增多，角化过度，KRT6（活化标志）、KRT14（基底层未分化标志）表达上调；KLK5（Kallikrein?5，激肽释放酶5）、PAR2（F2RL1）、TSLP、IL?33在表皮全层显著升高。scRNA?seq显示PAR2在角质形成细胞簇富集，淋巴水肿皮肤中以分化中及应激反应角质形成细胞亚群PAR2表达升高为主，整体PAR2⁺角质形成细胞比例略有下降系细胞状态组成偏移所致，并非蛋白水平无变化。表明淋巴损伤后角质形成细胞活化、去分化并上调KLK5–PAR2–Th2诱导细胞因子轴。

2.2 角质形成细胞Th2诱导细胞因子表达在淋巴损伤后迅速升高且早于T细胞炎症反应

小鼠尾淋巴水肿模型显示，术后2周即出现明显角化过度与KRT14、KLK5、PAR2、TSLP、IL?33、Ki67、IL?1α上调，且早于真皮CD3⁺T细胞浸润（术后4–6周才出现），证实表皮改变是淋巴损伤后的早期原发性事件，角质形成细胞激活先于适应性免疫细胞招募。

2.3 PAR2缺陷减轻Th2炎症与淋巴水肿

全局PAR2KO小鼠术后6周尾肿胀较野生型（Wild Type, WT）减轻约50%，胶原Ⅰ沉积减少，CD4⁺T细胞浸润降低，淋巴管直径缩小、数量增多；表皮KRT6、TSLP、IL?33表达下降，引流淋巴结朗格汉斯细胞及皮肤Th2细胞减少。骨髓嵌合实验（WT→PAR2KO，即造血细胞PAR2正常、角质形成细胞PAR2缺失）与角质形成细胞特异性PAR2^cko小鼠表型与全局PAR2KO一致，而WT→WT或PAR2^fl/fl对照无改善，证明是角质形成细胞而非造血/内皮细胞源PAR2主导淋巴水肿发展。

2.4 局部抑制TSLP减轻继发性淋巴水肿病理

术后2周起局部每日涂抹2 mM黄芩素（Baicalein，TSLP抑制剂）持续4周，小鼠尾肿胀显著受抑，表皮厚度、Ki67⁺细胞数、KRT6/KRT14及TSLP/IL?33表达降低，淋巴管扩张减轻；同期腹腔注射抗IL?1α中和抗体无效，排除非特异性抗炎作用，证实阻断角质形成细胞源性TSLP可打断Th2炎症级联。

2.5 淋巴液通过PAR2依赖机制激活角质形成细胞增殖与细胞因子表达

人淋巴液（hLF）体外刺激人原代角质形成细胞，KRT6、Ki67、KLK5、PAR2、TSLP的mRNA与蛋白表达升高；加入PAR2小分子抑制剂ENMD?1068或广谱丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF可逆转上述效应，证实淋巴液中富集的蛋白酶（如KLK、凝血因子等）通过裂解激活PAR2，诱导角质形成细胞增殖及Th2诱导细胞因子产生。

2.6 淋巴液含蛋白酶并以PAR2依赖方式诱导小鼠角质形成细胞TSLP表达

小鼠淋巴液（mLF）蛋白组学鉴定出含KLK1、Cathepsin等丝氨酸蛋白酶；mLF刺激原代小鼠角质形成细胞上调KRT6、PAR2、TSLP、IL?33；PAR2 siRNA敲低后TSLP诱导被显著抑制，进一步确认KLK5–PAR2轴介导淋巴液触发Th2诱导细胞因子转录。

2.7 Teriflunomide（TF）在体外抑制hLF诱导的角质形成细胞增殖

25 μM TF处理hLF刺激的人角质形成细胞，增殖（MTT法）受抑，KRT6、Ki67、KLK5、PAR2、TSLP表达降至基线附近，效果优于ENMD?1068；TF对人皮肤成纤维细胞及淋巴管内皮细胞增殖无影响，说明其选择性作用于快速增殖的活化角质形成细胞。

2.8 局部TF减轻继发性淋巴水肿的表皮改变与其他病理改变

小鼠术后2周起局部每日涂抹27 mg/mL TF持续4周，尾肿胀迅速消退，6周时接近正常；真皮CD4⁺浸润、Ⅰ型胶原沉积减少，淋巴管形态改善，表皮KLK5、PAR2、TSLP、IL?33及Ki67、KRT6下调。低剂量（14 mg/mL）TF也可在4周后显效。若术后即刻开始短期（2周）TF干预，同样能阻止早期角质形成细胞活化与肿胀发生，证实局部TF通过抑制角质形成细胞增殖及继发PAR2–Th2诱导细胞因子上调发挥防治作用。

四、讨论与结论翻译

讨论指出，本研究首次证实淋巴损伤后滞留的淋巴液通过其中蛋白酶激活角质形成细胞表面PAR2，促使角质形成细胞增殖、去分化并分泌TSLP、IL?33等Th2诱导细胞因子，进而激活朗格汉斯细胞迁移与Th2分化T细胞浸润，形成慢性炎症环路驱动纤维化与淋巴功能恶化。单细胞解析揭示PAR2在特定活化角质形成细胞状态上调，角质形成细胞内在PAR2信号是淋巴水肿发展的必要条件。局限性包涵小鼠模型与人体差异、仅收集Ⅱ期患者LF作体外刺激等。

结论翻译如下：

综上所述，本研究表明角质形成细胞通过协调Th2炎症反应在继发性淋巴水肿的发生发展中发挥主动作用。抑制角质形成细胞的这些改变在临床前模型中极为有效，可能代表一种预防或治疗淋巴水肿的新策略。