在埃塞俄比亚的亚的斯亚贝巴，之前的怀孕会消耗母亲体内的叶酸储备，从而增加胎儿出现神经管缺陷的风险

《The Journal of Nutrition》：Prior pregnancies deplete maternal folate status and increase risks of neural tube defects in Addis Ababa, Ethiopia.

　　哈塞特·塔米拉特·莫拉（Hasset Tamirat Molla）| 爱德华·J·M·乔伊（Edward J.M. Joy）| 道德·加舒（Dawd Gashu）| 德米拉沃·比基拉（Demiraw Bikila）| 塔德塞·莱吉萨·加罗姆萨（Tadesse Lejisa Garomsa）| 芭芭拉·斯托克（Barbara Stoecker）| 范妮·桑达利纳斯（Fanny Sandalinas）
埃塞俄比亚亚的斯亚贝巴大学食品科学中心

**摘要**
**背景**
叶酸对胎儿神经发育至关重要，孕妇在怀孕早期缺乏叶酸会增加神经管缺陷（NTDs）的风险。埃塞俄比亚的神经管缺陷发生率在全球范围内属于较高水平，但关于孕妇叶酸状况的决定因素的数据却非常有限。
**目的**
本研究旨在探讨饮食和人口统计因素在决定孕妇叶酸状况中的作用，并将这些发现置于神经管缺陷预防的背景下进行解读。
**方法**
我们在埃塞俄比亚亚的斯亚贝巴的三个公共卫生中心对首次进行产前检查的孕妇（n = 404人）进行了横断面研究。通过电化学发光免疫测定法（electrochemiluminescence immunoassay）检测血清叶酸水平。将血清叶酸水平低于24.3 nmol/L定义为神经管缺陷风险增加的临界值。通过问卷收集了社会人口统计学、饮食和临床数据，并使用线性回归模型分析影响血清叶酸浓度的因素。
**结果**
61%的孕妇叶酸水平低于预防神经管缺陷所需的水平。补充叶酸的情况很少见（<3%）。调整了财富水平、居住地、饮食摄入量、BMI、炎症指标和妊娠阶段后，发现：
- 有两次妊娠史的孕妇血清叶酸水平较低（β = -2.2 nmol/L；p = 0.04）；
- 有三次妊娠史的孕妇血清叶酸水平较低（β = -6.2 nmol/L；p < 0.001）；
- 有四次妊娠史的孕妇血清叶酸水平较低（β = -11.2 nmol/L；p < 0.001）；
- 有五次妊娠史的孕妇血清叶酸水平较低（β = -13.7 nmol/L；p < 0.001）。
此外，第二孕期的血清叶酸水平高于第一孕期（β = 3.90 nmol/L；p = 0.003）。
**结论**
多次妊娠与较低的叶酸水平显著相关，这可能与叶酸消耗增加有关。多次妊娠的孕妇可能面临更高的神经管缺陷风险。在埃塞俄比亚，应优先考虑采取干预措施来改善孕前叶酸状况，包括补充叶酸、食品强化以及延长妊娠间隔时间。

**引言**
叶酸是一种水溶性B族维生素，对生命全程都至关重要，尤其是在人类发育的早期阶段（1）。由于叶酸在DNA、RNA和蛋白质合成中的关键作用，怀孕期间叶酸不足会导致多种不良后果（1），例如由于神经管在受精后21至28天内未能闭合而引起的先天性脑和脊髓畸形。这些神经管缺陷（NTDs）占全球所有先天性疾病的约十分之一，是仅次于先天性心脏病和唐氏综合征的第三大常见先天性疾病（2）。
埃塞俄比亚的神经管缺陷负担尤为严重。一项荟萃分析估计，该国每10,000例新生儿中有71.5例患有神经管缺陷（95% CI：57.8–86.6）（3），这一比例是撒哈拉以南非洲地区平均水平的约七倍（4）。马德里等人报告称，东埃塞俄比亚因神经管缺陷导致的5岁以下儿童死亡率为每10,000例活产中有104例，是其他八个研究地点观察到的死亡率的4-25倍（4）。尽管通过充足的叶酸摄入和孕前补充可以预防神经管缺陷（1），但低叶酸水平仍然普遍存在。
全球数据显示，大多数育龄非孕妇中叶酸缺乏现象普遍（5）。2015年的埃塞俄比亚全国微量营养素调查显示，78%的非孕妇红细胞叶酸水平表明她们有较高的神经管缺陷风险，且这种风险存在地区差异（6, 7）。虽然埃塞俄比亚缺乏孕妇叶酸状况的全国性数据，但基于社区的研究一致显示孕妇中叶酸缺乏率较高。在东埃塞俄比亚的两项研究中，近一半的孕妇被归类为叶酸缺乏（8, 9）；而在亚的斯亚贝巴的一项医院研究中，28%的孕妇红细胞叶酸水平低于预防神经管缺陷所需的阈值（400 ng/mL）（10）。
大多数关于怀孕期间叶酸状况决定因素的研究来自高收入国家，这些研究主要关注补充叶酸与叶酸状况之间的关联（11, 12）。比利时和荷兰的研究（11, 12）发现，补充叶酸和社会经济地位是怀孕期间叶酸状况的主要预测因素。然而，这些发现可能不适用于低收入和中等收入国家（LMICs），因为这些国家的饮食多样性较低，叶酸补充剂不易获得，且孕前护理服务有限或利用率不足（13, 14）。因此，了解埃塞俄比亚孕妇的叶酸状况背后的社会经济和饮食因素对于制定有效且公平的干预措施以缓解叶酸缺乏和预防神经管缺陷至关重要。

**方法**
研究选择了埃塞俄比亚亚的斯亚贝巴的公共卫生中心，因为这些中心是孕前护理的主要入口点。从十个城市行政区中随机选择了三个子城市（Nifas Silk Lafto、Addis Ketema和Bole），每个子城市选取了一家公共卫生中心作为研究地点。
**参与者**
筛选标准为2022年4月至8月期间在孕前检查中的孕妇。纳入标准为：
- 正处于怀孕第一或第二孕期的首次孕前检查；
- 排除了处于第三孕期的孕妇（因为研究关注的是怀孕早期的叶酸状况决定因素）；
- 排除了病情严重或住院的孕妇（如需要住院治疗的急性疾病、高血压疾病、大出血、需要手术干预的并发症等）；
- 排除了无法提供知情同意的孕妇。
所有符合条件的孕妇均被连续接触，直至达到样本量。只有提供书面知情同意的孕妇才被纳入研究（图1）。

**样本量计算**
假设孕妇中叶酸缺乏的患病率为49.3%（8），计算得出样本量为384人，非应答率为10%，因此目标样本量为422人。

**实验室方法**
由资深实验室技术人员在非空腹状态下从孕妇体内采集5毫升静脉血，并将其置于血清分离管中。样本采集后30-60分钟进行离心处理，然后将血清分装到冷冻管中。为防止叶酸降解，使用铝箔保护试管并避免光照。样本在相应卫生中心的实验室中储存于-20°C，待转运至埃塞俄比亚公共卫生研究所（EPHI）的国家临床化学参考实验室后继续储存于-80°C直至检测。样本在检测前仅冷冻和解冻一次。

**数据分析**
血清叶酸水平使用全自动免疫分析仪（Roche/Hitachi Cobas 6000(e601，Roche Cobas 6000系列；德国）和商业试剂盒（Roche）进行检测。同时分析了两个质量控制样本（PreciControl Varia 1（3.9 ng/mL）和PreciControl Varia Two（12 ng/mL，Roche）以评估检测质量。使用Levey–Jennings图表监测质量控制结果，并应用Westgard规则确保检测性能在可接受范围内。
高灵敏度的C-反应蛋白（CRP）和α-1-酸糖蛋白（AGP）浓度使用全自动临床化学分析仪（Roche/Hitachi Cobas 6000（c501，Roche Cobas 6000系列；德国）进行检测。

**饮食数据**
根据受访者回忆的前三天内的食物摄入情况计算饮食多样性得分。此外，使用食物频率问卷（FFQ）评估20类食物的每周摄入频率，其中包括富含叶酸的食物。

**补充剂数据及其他可能影响叶酸状况的生活方式因素**
通过问卷了解参与者在孕前或怀孕早期是否补充叶酸、是否使用酒精、烟草、大麻（Catha edulis）等物质，以及是否使用可能干扰叶酸代谢的药物（如用于治疗不孕症的克罗米芬柠檬酸和用于治疗癫痫的丙戊酸钠）。

**临床数据**
根据参与者的最后一次正常月经日期或早期超声检查结果确定妊娠年龄（GA）。数据收集人员还根据医疗记录确认了妊娠年龄。
妊娠次数定义为女性之前的怀孕次数，不论妊娠结局如何。首次妊娠定义为第一次怀孕，多次妊娠定义为两次或以上怀孕（包括当前妊娠）。

**伦理批准与研究参与同意**
本研究方案获得了亚的斯亚贝巴大学（IRB # 04-14-2021）和俄克拉荷马州立大学（IRB # IRB-24-234）的机构审查委员会（IRB）以及埃塞俄比亚教育部国家研究伦理审查委员会（NRERB，IRB # 17/246/818/22）的批准。数据分析方案还获得了LSHTM观察研究伦理委员会（参考编号32432，2025年6月19日）的批准。
在研究开始前，向各卫生中心的首席执行官提交了正式的批准申请，说明了研究目的、数据收集程序及拟用的参与者信息表，并请求访问潜在参与者的医疗记录。随后，医疗主任批准了该研究，强调了研究的伦理合规性。招募过程遵循了知情同意程序。

**统计分析**
主要结果是血清叶酸浓度（nmol/L），既作为连续变量也作为神经管缺陷风险增加的二元指标进行评估。
世界卫生组织不推荐使用血清叶酸浓度作为预测神经管缺陷风险的临界值，因为红细胞叶酸是更优选的生物标志物。然而，最新建模研究表明，血清叶酸浓度为24.3 nmol/L与最佳神经管缺陷预防效果相关（15）。因此，该阈值被用作人群叶酸充足性的参考标准。
基于现有文献（补充图1），构建了一个概念框架来支持因果分析，考虑了暴露因素与孕妇叶酸状况之间的生物学关联。分析中纳入的暴露变量包括妊娠次数、妊娠年龄（周数）、母亲年龄（岁数）、孕前和怀孕早期的叶酸补充情况、饮食多样性得分以及富含叶酸的食品摄入情况。教育水平、家庭收入五分位数、职业、宗教信仰、炎症标志物（CRP和AGP）被作为潜在的混杂因素。
妊娠年龄分为两个阶段：<14周（第一孕期）和14-27周（第二孕期）。通过将家庭月收入分为五分位数来创建财富变量。教育程度、职业和宗教信仰被作为分类变量。
使用直方图/箱线图和散点图分析了血清叶酸与各暴露因素之间的关系。通过线性回归估计关联，分别报告了（i）未调整模型和（ii）调整了预设协变量的模型。通过诊断图检查模型假设，包括线性、同方差性和残差的正态性。由于妊娠年龄与叶酸之间的关系非线性，还测试了其他模型规格（如二次项和样条项）。为了解释主要预测因子的多重假设检验，应用了Benjamini–Hochberg程序（16）进行假发现率（FDR）调整。
由于第一孕期神经管形成对叶酸的需求最高，且多次妊娠的孕妇可能比首次妊娠的孕妇叶酸储备更低，因此检测了妊娠次数与妊娠阶段之间的交互作用。由于缺乏生物学依据，未考虑其他变量之间的交互作用。对于第二次妊娠次数超过三次的孕妇，将其合并为一组进行统计分析。

**敏感性分析**
首先，由于孕妇的高炎症状态可能反映多种影响其饮食、健康和微量营养素状况的因素，我们重复了仅限于CRP < 5 mg/L参与者的线性回归分析。其次，由于15个血清叶酸检测值处于检测上限（45.4 nmol/L），我们使用了右删失的Tobit回归模型（删失点=45.4 nmol/L）来处理这些超出检测范围的观测值。所有分析均在R语言和R Studio 2024.4.2.764版本中进行，使用了以下包：dplyr和tidyr用于数据处理，ggplot2用于数据可视化，censReg用于处理带有删失数据的敏感性分析，car和splines用于检验线性模型假设。

在邀请参与研究的450名妇女中，有422人（93.8%）成功入组，其中404人（95.7%）的血清叶酸水平得到了测量（图1）。有7名妇女的教育水平信息缺失，另有1名妇女未报告是否服用了叶酸补充剂。所有其他变量的数据均完整，这种较低的缺失值水平预计不会影响分析结果。参与者主要居住在城市地区，尤其是亚的斯亚贝巴或邻近的奥罗米亚地区。大多数妇女处于妊娠的第一孕期（85%），平均妊娠期为11周。30%的妇女是首次怀孕。

共有61%的妇女血清叶酸浓度低于预防神经管缺陷（NTDs）所需的水平。平均饮食多样性得分为3.8（标准差0.9），涵盖了10个食物组（表1）。没有妇女报告吸烟或使用任何已知会改变叶酸代谢的药物。

表1. 参与者的社会人口学特征。

| 变量 | 平均值（SD） | 中位数（IQR） | 缺失值数量（百分比） |
|-----------------|---------|-----------|-----------------|
| 母亲年龄（岁） | 26.4（4.4） | 0 | |
| 教育水平 | 无正式教育 | 6（2%） | |
| | 小学 | 162（40%） | |
| | 中学 | 192（48%） | |
| | 高等教育及以上 | 37（10%） | |
| 居住地 | 城市 | 371（92%） | |
| | 农村 | 33（8%） | |
| 地区 | 亚的斯亚贝巴 | 310（77%） | |
| | 奥罗米亚 | 94（23%） | |
| 宗教信仰 | 穆斯林 | 206（51%） | |
| | 正统派 | 172（43%） | |
| | 新教 | 26（6%） | |
| 职业 | 政府雇员 | 20（5%） | |
| | 私人雇员 | 52（13%） | |
| | 私营企业 | 36（9%） | |
| 家庭主妇 | 232（57%） | |
| | 无职业 | 63（16%） | |
| 妊娠阶段 | 第一孕期 | 343（85%） | |
| | 第二孕期 | 61（15%） | |
| 婚姻状况 | 已婚 | 401（99%） | |
| | 单身/丧偶 | 3（1%） | |
| 怀孕次数（包括本次） | 1-2次 | 112（30%） | |
| | 3-4次 | 109（27%） | |
| | 5次及以上 | 454（13%） | |
| 体重指数（kg/m2） | 24（1.0） | 0 | |
| 血清叶酸（nmol/L） | 22.8（9.2） | |
| C-反应蛋白（mg/L） | 1.6（0.8, 4.0） | |
| 血清叶酸<24.3 nmol/L | 247（61%） | |

**单变量分析**
在未调整的线性回归模型中，多个母亲和社会经济因素与血清叶酸浓度相关（表2）。怀孕次数越多，血清叶酸浓度越低：两次怀孕的妇女血清叶酸浓度比首次怀孕的妇女低3.0 nmol/L，五次怀孕的妇女低16.7 nmol/L（p < 0.001）。第二孕期的血清叶酸浓度高于第一孕期（β = 8.3 nmol/L；p < 0.001）。母亲年龄增加、体重指数（BMI）升高、居住在城市以及家庭收入较高都与血清叶酸浓度呈负相关。正统派妇女的叶酸浓度高于穆斯林妇女。

**多变量模型**
在调整了饮食、社会经济和炎症因素后的多变量线性回归模型中，怀孕次数越多，血清叶酸浓度越低：两次怀孕的妇女血清叶酸浓度比首次怀孕的妇女低2.2 nmol/L（p = 0.04），三次怀孕的妇女低6.2 nmol/L（p < 0.001），四次怀孕的妇女低11.2 nmol/L（p < 0.001），五次怀孕的妇女低13.7 nmol/L（p < 0.001）。

**敏感性分析**
排除炎症水平升高的妇女（CRP > 5 mg/L；n = 78）后，结果没有改变。Tobit回归模型（考虑了检测上限的右删失）的结果与调整后的线性回归模型一致，表明检测上限附近的样本数量较少并未影响分析结果。

**讨论**
主要发现：
- 61%在亚的斯亚贝巴进行首次产前检查的孕妇血清叶酸浓度低于预防NTDs所需的水平。这一比例高于之前在亚的斯亚贝巴医院进行的研究结果，也与2015年全国微量营养素调查中的全国叶酸缺乏率相符。
- 我们的研究提供了低收入和中等收入国家（LMIC）的新实证证据，表明多次怀孕会增加代谢负担，消耗母亲体内的叶酸储备，从而显著增加NTDs的风险。
- 怀孕次数和妊娠阶段是影响叶酸水平的最强预测因素：多次怀孕的妇女在第一孕期的血清叶酸浓度显著低于首次怀孕的妇女。
- Bradfield Hill因果框架的多个要素支持这一结论：怀孕次数越多，叶酸水平越低。时间顺序上，怀孕总是先于血清叶酸的测量；观察到的剂量-反应关系在调整社会经济、饮食和炎症因素后仍然存在；这一现象具有生物学合理性。
- 饮食多样性和叶酸摄入量与血清叶酸浓度无关。
- 正统派妇女的血清叶酸浓度高于穆斯林妇女，但这可能与她们平均怀孕次数较多有关。

**结论**
- 多次怀孕会增加叶酸消耗，导致母亲体内叶酸储备逐渐减少，从而增加NTDs的风险。
- 饮食指标和叶酸摄入量与血清叶酸浓度无关。观察到的已知膳食叶酸来源与母亲叶酸状态之间缺乏关联是出乎意料的。然而，参与者之间的饮食异质性较低，且膳食指标可能过于粗糙，无法区分叶酸摄入量的差异。

**政策相关性**
在埃塞俄比亚，母亲营养不良仍然是导致不良妊娠结局的关键因素。我们的研究结果表明，即使在城市地区、接受医疗服务的群体中，许多女性在怀孕时叶酸水平也不足。令人担忧的是，其他研究表明，在亚的斯亚贝巴以外的几个地区，成年女性中叶酸缺乏的情况更为普遍（6），而在东埃塞俄比亚，未接受产前护理的母亲所生的儿童中，神经管缺陷（NTDs）的发生率更高（4）。孕妇血清叶酸水平低凸显了针对孕前期的有效干预措施的必要性。埃塞俄比亚已经制定了国家孕前护理指南（31），其中强调了叶酸补充的必要性，这与世界卫生组织的建议一致。我们的研究结果强调了这一政策的公共卫生意义，并为政策的实施提供了及时的证据支持，例如通过加强对多产妇女的宣传教育。此外，我们的研究还表明，将目前的铁-叶酸补充建议扩展到产后期可能有助于母亲叶酸储备的恢复，从而对后续妊娠产生积极影响。通过大规模食品强化也可以在人群层面改善叶酸水平。2024年，埃塞俄比亚启动了由埃塞俄比亚食品药品管理局（EFDA）主导的强制性国家食品强化计划，要求在国内生产和进口的小麦粉中添加关键微量营养素，包括叶酸。尽管主要面粉加工企业已经开始实施这一计划，但初步评估显示合规性存在差异，监管执行也存在挑战。此外，农村和低收入家庭的小麦粉消费差异可能限制了食品强化的整体效果。目前正在进行研究，以确定叶酸强化盐的可行性和有效性，因为叶酸强化盐在埃塞俄比亚的普及程度高于小麦粉（32）。此外，最近的研究指出，多样化农业食品系统对于支持埃塞俄比亚人群的叶酸水平至关重要（6）。

**优势与局限性**
本研究有几个优势：首先，研究在怀孕早期就招募了参与者，从而能够独特地了解低收入和中等收入国家（LMIC）环境中孕早期的叶酸状况。平均妊娠期为11周，表明大多数女性在孕早期末期才进行首次产前检查。这种相对较早的就诊时间可能反映了人们对早期妊娠护理意识的提高、公共卫生中心母婴健康服务的改善以及卫生推广工作者在社区层面的健康教育（33）。在埃塞俄比亚，早期产前检查的启动还可能受到免费产前服务、对母亲营养的关注以及教育普及带来的更多就医行为的推动（34）。由于补充叶酸的使用率较低，本研究能够不受其影响地评估叶酸状态，这与高收入国家的大多数研究结果不同。因此，我们能够清楚地识别出基于模型研究假设的妊娠期效应，或在高收入国家背景下观察到但统计确定性有限的效应。研究采用了严谨的设计方法，全面收集了影响叶酸状态的因素（如补充叶酸的使用、富含叶酸的食品摄入、已知会改变叶酸代谢的药物以及其他母亲健康状况），并使用了可靠的统计方法（如预先定义的暴露因素和多重假设检验的调整）。

然而，也有一些局限性：膳食数据基于短期回忆，可能无法反映长期摄入情况；血清叶酸水平仅反映近期摄入情况，无法全面反映长期叶酸状况；测量红细胞叶酸水平将有助于更准确地解释结果。血清叶酸的测定采用了基于叶酸结合蛋白的免疫测定法，而非金标准的微生物学或LC-MS/MS方法（35），这可能会低估叶酸浓度，尤其是在较高水平时。不过，由于测量误差在各个妊娠组中预计相似，因此这种低估不太可能影响血清叶酸水平与妊娠次数之间的关联。系统性炎症可能直接影响叶酸代谢，或反映影响营养吸收的潜在健康问题（36）。但在本研究中，C反应蛋白（CRP）和α-甘油磷酸（AGP）与血清叶酸浓度均无独立关联，排除CRP水平升高的女性并未改变研究结果。这表明炎症不太可能是该队列中叶酸耗竭的主要驱动因素，也无法解释妊娠次数与叶酸状态之间的强烈负相关关系。最后，本研究仅在亚的斯亚贝巴的城市医疗机构进行，需要在其他地区开展类似研究，以获得更具代表性的数据。

**结论**
在亚的斯亚贝巴接受首次产前检查的孕妇中，叶酸水平普遍较低，超过一半女性的血清叶酸浓度低于预防神经管缺陷所需的水平。妊娠次数与叶酸状态呈强烈负相关，且妊娠期的影响表明，多产女性在怀孕早期特别容易发生叶酸耗竭，而此时叶酸对胎儿神经发育最为关键。与高收入国家的研究结果不同，这些结果并未受到叶酸补充的影响，因为该群体中叶酸补充的使用率非常低。因此，大多数女性在怀孕时叶酸储备不足，这凸显了埃塞俄比亚当前母婴营养策略中的关键缺口。应优先通过扩大孕前护理、增加孕前叶酸补充的获取途径以及大规模食品强化来改善叶酸状态，以降低可预防的神经管缺陷风险。

**贡献者**
HTM：概念构思、数据整理、正式分析、研究设计、方法学、项目管理、初稿撰写、审稿与编辑。
EJMJ：概念构思、资金获取、项目管理、方法学、监督、初稿撰写、审稿与编辑。
DG：项目管理、监督、资金获取、审稿与编辑。
DB：研究实施、资源协调、审稿与编辑。
TLG：研究实施、资源协调、审稿与编辑。
BS：方法学设计、资源协调、监督、审稿与编辑。
FS：概念构思、数据整理、正式分析、软件应用、方法学设计、监督、初稿撰写、审稿与编辑。
所有作者均阅读并批准了最终版本。

**数据可用性声明**
本研究生成和分析的数据不对外公开。参与者同意书和批准的伦理协议均未允许数据超出项目范围共享，这体现了对数据保密性的考虑。合理的访问请求将逐案考虑，需符合数据转移协议并获得伦理委员会的批准。仅可共享去标识化的数据。如有查询，请联系第一作者。数据收集工具、数据分析用R脚本以及未包含在论文中的汇总统计信息（如特定亚组的数据）可应要求提供。

**资金支持**
本研究得到了盖茨基金会“GeoNutrition”项目[INV-009129]和“微量营养素行动政策支持”项目[INV-002855]的支持。本文中的结论和观点仅代表作者本人，并不代表基金会的立场。根据基金会的资助条款，已为可能由此产生的接受稿件版本分配了Creative Commons Attribution 4.0许可。资助方未参与数据的设计、实施、分析和解释工作。