基底细胞通过SP1介导的衰老相关分泌表型参与肺纤维化

《The Clinical Respiratory Journal》：Basal Cells Contribute to Pulmonary Fibrosis via SP1-Mediated Senescence-Associated Secretory Phenotype

　　

摘要：特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）是一种进展性间质性肺疾病，治疗选择有限且预后差。越来越多证据表明气道上皮重塑参与疾病发病过程，但基底细胞（basal cells）的作用尚未完全明确。本研究旨在探讨基底细胞是否通过转录因子SP1（specificity protein 1）调控的衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）参与肺纤维化。方法：比较接受经支气管冷冻肺活检的IPF患者肺组织与良性结节行肺叶切除患者的对照肺组织，采用组织病理学分析及免疫组织化学评估基底细胞分布并量化细胞特异性标记物；分析GEO数据库转录组数据以鉴定差异表达基因及富集信号通路；在博来霉素（bleomycin）诱导的小鼠肺纤维化模型中验证发现，并通过蛋白分析评估SP1表达。结果：纤维化气道中基底细胞显著增多并从细支气管延伸至成纤维细胞灶，其丰度与纤维化严重程度呈正相关；差异基因表达分析显示SASP相关通路富集，包括基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）和趋化因子上调；小鼠模型中SASP相关介质显著升高，纤维化肺组织中SP1表达增加。结论：基底细胞可能主动参与肺纤维化发生发展，SP1介导的衰老相关分泌表型可能是潜在的新型致病机制。靶向基底细胞功能异常或SP1相关通路可为IPF提供新的治疗方向。

本文对发表于《The Clinical Respiratory Journal》的研究论文《基底细胞通过SP1介导的衰老相关分泌表型参与肺纤维化》进行解读与总结。

研究背景与立题依据

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）是一种以细胞外基质过度沉积、成纤维细胞增殖及肺泡结构破坏为特征的致死性进展性间质性肺疾病，确诊后中位生存期仅3–5年，现有抗纤维化治疗仅能延缓而无法逆转病程。传统观念认为IPF是肺泡上皮及间质病变，但近年研究发现远端小气道也存在结构和功能异常——IPF最强遗传危险因素MUC5B启动子变异导致远端气道黏液分泌异常，肺移植标本可见终末细支气管丢失及支气管周重塑，提示气道上皮细胞可参与致纤维化过程。气道基底细胞（basal cells，表达p63/KRT5）是气道上皮祖细胞，已有文献报道其在纤维化肺中增生，但其具体致病机制不明。细胞衰老及衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）可使衰老上皮细胞分泌促炎及促纤维化介质，然而IPF中基底细胞是否获得SASP表型及其上游调控机制均不清楚。因此，本研究拟明确IPF肺小气道基底细胞变化、与纤维化程度的关系，以及SP1（specificity protein 1，转录因子SP1）介导的SASP通路在其中的作用。

主要关键技术方法概述

研究人员收集中日友好医院行经支气管冷冻肺活检（transbronchial cryobiopsy, TBCB）确诊IPF患者肺组织（n=13）及肺良性结节切除术中远离结节（>2 cm）大体正常肺组织作为对照（n=8），匹配吸烟史。进行HE染色、Masson三色染色及免疫组化检测纤毛上皮细胞标记FoxJ1和基底细胞标记p63，Image-Pro Plus定量染色面积与吸光度，按Szapiel法评纤维化程度并做相关性分析。利用GEO数据集GSE136831（单细胞RNA测序）筛选IPF与对照组支气管基底细胞差异表达基因（DEGs），limma包分析，GO及KEGG数据库富集分析。采用腹腔注射博来霉素（bleomycin, BLM，35 mg/kg，每周2次共4周）建立C57BL/6雄性小鼠（6–8周龄）肺纤维化模型，设生理盐水对照，于第1、2、4、6、8、10周取材，Western blot检测SASP分子（MMP1、MMP7、MMP11、CCL5、CCL19）及SP1表达，TRRUST数据库预测SP1为DEGs上游调控因子。统计学采用SPSS 26.0，t检验或卡方检验及Pearson/Spearman相关分析，p<0.05为差异有统计学意义。

研究结果

2.1 IPF小气道病理特征及基底细胞异常

研究人员对IPF与对照肺组织行HE、Masson三色、FoxJ1及p63免疫组化染色发现，IPF组小气道上皮水肿、纤毛上皮减少、基底细胞明显增生并密集排列于基膜；部分标本见基底细胞从细支气管向成纤维细胞灶延伸。提示IPF中存在小气道上皮病变伴基底细胞增生及异位分布。

2.2 免疫组化染色的吸光度测定

IPF组FoxJ1染色面积（3962.24 vs. 4651.71 μm²）与吸光度（2070.28 vs. 1968.29）与对照组比无显著差异（p=0.634、0.896）；而p63染色面积（6364.40 vs. 498.00 μm²，p=0.011）与吸光度（2624.08 vs. 250.86，p<0.001）均显著高于对照组。表明IPF小气道基底细胞数量及蛋白表达水平显著升高，纤毛细胞未显著增加。

2.3 免疫组化染色与IPF纤维化程度的相关性分析

p63染色面积和吸光度均与局部纤维化评分呈正相关（均p<0.001）；FoxJ1染色面积和吸光度与纤维化程度呈负相关（p=0.002、0.005）。结合镜下见p63阳性基底细胞自小气道壁伸入纤维化区域包绕成纤维细胞灶，提示基底细胞增生程度与纤维化严重性相关，且其可侵入纤维化病灶。

2.4 SP1介导的基底细胞SASP可能参与小气道上皮细胞致纤维化过程

对GSE136831数据集IPF与对照基底细胞差异表达基因（|log₂FC|>1）做GO及KEGG富集分析，上调基因显著富集于线粒体呼吸链、氧化磷酸化、电子传递链、蛋白酶体及核糖体等通路，与SASP核心触发机制（线粒体功能障碍致ROS升高、内质网应激致蛋白稳态失衡→DNA损伤反应激活→细胞周期阻滞及SASP因子分泌）相符。博来霉素小鼠模型支气管组织中MMP1、MMP7、MMP11、CCL5、CCL19等SASP相关分子表达较对照显著升高，纤维化期高于早期；支气管SP1蛋白表达亦较对照明显上调，生物信息学提示SP1为上述基因潜在转录调控因子。提示基底细胞可能经SP1上调而激活SASP分泌谱，参与IPF发生发展。

讨论与结论总结

既往研究已报道IPF肺基底细胞扩增并可侵入肌成纤维细胞灶，本研究进一步从分子层面阐明其可通过SP1介导的SASP分泌促纤维化介质参与上皮—间质对话。作者指出本研究局限包括TBCB样本量偏小、对照为远离结节的"大体正常"肺组织而非绝对正常肺、未行基底细胞SP1条件性敲除或谱系示踪确证因果、博来霉素模型无法完全模拟人类IPF慢性异质性。未来需扩大样本、scRNA-seq解析基底细胞异质性、基底细胞—成纤维细胞共培养及SP1干预实验验证。

结论：研究人员证实IPF肺小气道基底细胞扩增且向纤维化灶延伸，其丰度与纤维化严重程度正相关；基底细胞中SASP相关通路富集，博来霉素模型中SASP介质及SP1表达升高；基底细胞可能通过SP1介导的衰老相关分泌表型主动参与肺纤维化进程，靶向基底细胞功能异常或SP1相关通路或为IPF提供新的治疗靶点。