JMJD3驱动的p16INK4a阳性细胞表观遗传重编程促进肌腱再生

《Bone Research》：JMJD3-driven epigenetic reprogramming of p16INK4a-positive cells promotes tendon regeneration

　　

肌腱愈合是一个涉及炎症、细胞重编程和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重塑的复杂生物学过程。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p16^INK4a是一种特征明确的肿瘤抑制因子，与细胞应激和衰老条件下的细胞周期调控相关。尽管p16^INK4a阳性细胞的基因消融在年龄相关性肌腱病中显示出有益效果，但p16^INK4a阳性细胞在肌腱再生过程中的细胞特性和功能贡献仍知之甚少。本研究中，研究人员证明在小鼠跟腱损伤模型中，损伤诱导的p16^INK4a阳性细胞积累促进肌腱结构和功能恢复。利用小鼠肌腱穿刺模型结合单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）和原位免疫染色，研究人员鉴定这些p16^INK4a阳性细胞主要为以ECM基因表达升高为特征的间充质细胞。机制上，p16^INK4a阳性细胞表现出组蛋白去甲基化酶JMJD3（KDM6B）活性增加，伴随H3K27me3水平降低和ECM相关基因（包括Col1a1和Col3a1）表达增强，从而支持有组织的胶原沉积和组织重塑。JMJD3的基因缺失或药理学抑制导致H3K27me3水平升高、胶原组织紊乱和生物力学强度降低。相反，H3K27me3的药理学降低与ECM基因表达增强和肌腱修复加速相关。这些发现共同鉴定了p16^INK4a阳性细胞中JMJD3相关表观遗传程序对肌腱愈合期间ECM重塑的贡献，突出了p16^INK4a阳性细胞在肌肉骨骼组织修复中的有益且环境依赖性的作用。

肌腱损伤是一种常见的肌肉骨骼疾病，由于肌腱组织固有的再生能力有限，常导致不完全愈合和持续性功能障碍。与其他结缔组织不同，肌腱倾向于通过形成纤维化瘢痕组织而非再生其天然层次结构来愈合，导致弹性降低和再断裂风险增高。尽管手术技术和康复策略不断进步，但调控成功肌腱修复的生物学机制仍不完全清楚，因此亟需阐明促进功能性再生的内源性细胞程序。表达细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p16^INK4a的细胞传统上被视为应激细胞，在细胞衰老和年龄相关组织功能障碍的背景下进行研究，因为p16^INK4a表达在衰老或慢性损伤组织中常增加。在这些情况下，p16^INK4a阳性群体与纤维化及持续性炎症相关，通过有害分泌如衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）因子发挥作用。然而，来自急性损伤模型的累积证据表明，p16^INK4a阳性细胞虽然可能不完全符合经典衰老的全部标准，但也可以在早期组织修复过程中暂时出现并参与再生过程。

本研究发表于《Bone Research》，旨在探究p16^INK4a阳性细胞在肌腱修复中的功能角色。研究人员采用小鼠跟腱穿刺模型，观察到p16^INK4a阳性细胞在肌腱愈合过程中于损伤部位暂时积累，并具有衰老相关特征。与传统认为p16^INK4a阳性细胞有害的观点相反，这些细胞的耗竭损害了肌腱再生，导致胶原纤维紊乱和生物力学强度降低。机制上，研究人员鉴定出p16^INK4a阳性细胞表现出JMJD3的显著上调，导致H3K27me3去甲基化并随后激活ECM相关基因，包括Col1a1和Col3a1，共同促进胶原合成和基质重塑。JMJD3的遗传学和药理学抑制均消除了这些有益效应，凸显了JMJD3介导的表观遗传重塑在协调肌腱愈合期间衰老相关促修复程序中的关键作用。

研究人员开展此项研究主要运用了以下关键技术方法：小鼠遗传学模型（包括p16-CreERT2::tdTomato报告基因小鼠、p16-CreERT2::iDTR条件性细胞消融小鼠，以及p16-CreERT2::JMJD3^flox/flox条件性基因敲除小鼠）、流式细胞术与荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）、单细胞RNA测序（数据来源为GEO数据库PRJNA976191和PRJNA975881）、组织学与组织化学染色（包括H&E染色、Masson三色染色、天狼星红染色结合偏振光显微镜观察）、免疫荧光染色与共聚焦显微镜成像、蛋白质印迹分析、定量实时PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）、生物力学测试，以及药理学干预（JMJD3抑制剂GSK-J4和EZH2抑制剂GSK-126）。

p16^INK4a阳性细胞促进小鼠肌腱愈合。研究人员利用p16-tdTOM报告基因小鼠，通过流式细胞术证实损伤后7天p16^INK4a阳性细胞比例从假手术组的0.87%±0.61%增加至5.32%±1.12%。免疫荧光显示损伤肌腱呈现强SA-β-gal阳性（增加5.48倍）和γH2AX灶点增加（增加9.95倍）。通过p16-iDTR小鼠选择性消融p16^INK4a阳性细胞后，组织学评估显示肌腱愈合受损，Masson三色染色显示胶原纤维紊乱、间充质细胞减少和持续炎症浸润。天狼星红-偏振光显微镜观察显示DT处理组双折射强度显著降低、纤维取向紊乱。qRT-PCR显示肌腱特异性标志物Tnc和Tnmd表达降低，生物力学测试显示极限拉伸强度和刚度显著下降。

p16^INK4a阳性细胞在肌腱损伤后获得促再生ECM分泌表型。利用已发表的单细胞转录组数据库（PRJNA976191），无偏聚类分析鉴定出八种主要细胞群体。Cdkn2a（p16）表达主要在间充质细胞中富集，并在14天达峰。亚聚类分析将间充质细胞分为p16^INK4a阳性和阴性群体，p16^INK4a阳性间充质细胞表现出显著更高的Col1a1和Col3a1表达。免疫荧光验证p16^INK4a阳性细胞主要定位于损伤组织并与间充质细胞标志物PDGFRα广泛共定位。DT处理后COL1和COL3表达显著降低，CD31⁺血管密度和PGP9.5⁺神经纤维密度也显著降低，表明p16^INK4a阳性间充质细胞具有更高的ECM合成活性并分泌旁分泌信号支持基质组织、新生血管化和神经长入。

肌腱损伤后p16^INK4a阳性细胞中JMJD3的表观遗传激活。scRNA-seq分析显示，在四种主要p16^INK4a阳性细胞群体（间充质细胞、巨噬细胞、内皮细胞、T细胞）中，组蛋白去甲基化酶Jmjd3（Kdm6b）在所有p16^INK4a阳性群体中一致且显著上调，尤其在免疫细胞中诱导最显著。Western blot和免疫荧光证实肌腱损伤后JMJD3表达升高，而DT消融p16^INK4a阳性细胞后JMJD3水平显著降低。

JMJD3介导的H3K27me3去甲基化激活p16^INK4a阳性细胞中的ECM合成。通过FACS分选p16^INK4a阳性和阴性间充质细胞，qRT-PCR显示p16^INK4a阳性间充质细胞中Jmjd3显著上调，Col1a1和Col3a1 mRNA水平显著升高。Western blot显示JMJD3蛋白水平升高，伴随H3K27me3整体降低。体外建立多柔比星诱导的p16^INK4a阳性NIH-3T3细胞模型，GSK-J4处理恢复H3K27me3积累并显著抑制Col1a1和Col3a1表达，而GSK-126处理降低H3K27me3并增强其表达。

p16^INK4a阳性细胞中JMJD3的丢失损害肌腱修复。构建JMJD3 iKO小鼠，SA-β-gal染色显示损伤肌腱中p16^INK4a阳性细胞显著减少。COL1、COL3、CD31和PGP9.5免疫荧光显示表达显著降低，H&E染色显示胶原纤维排列紊乱、横截面积减小、愈合界面细胞密度降低。

H3K27甲基化的药理学调控影响肌腱修复。野生型小鼠分别给予GSK-J4（2 mg/kg）或GSK-126（10 mg/kg）处理14天。GSK-J4导致ECM合成减少和肌腱愈合受损，而GSK-126产生更好的表型结果：Masson三色染色显示更有序的胶原排列和更致密的束间基质；生物力学测试显示极限拉伸强度和刚度恢复；COL1和COL3免疫荧光增加；天狼星红-偏振光显微镜显示GSK-126改善纤维取向一致性；qRT-PCR显示GSK-126部分恢复Tnc和Tnmd表达。

讨论部分，研究人员指出本研究鉴定了p16^INK4a阳性细胞通过JMJD3介导的H3K27me3去甲基化表观遗传机制在功能性肌腱再生中的先前未被重视的作用。利用p16报告基因和可诱导消融小鼠模型，研究人员证明p16^INK4a阳性细胞在肌腱愈合过程中积累，其耗竭显著损害胶原组织、血管化、神经支配和最终机械恢复。单细胞转录组学揭示p16^INK4a阳性间充质细胞是ECM组分的来源之一，表现出以增强胶原合成和基质重塑为特征的促再生转录程序。机制上，JMJD3在p16^INK4a阳性间充质细胞中被显著激活，导致抑制性H3K27me3标记的去除和ECM相关基因的转录激活。JMJD3的遗传学或药理学抑制抑制胶原合成并损害肌腱修复，而拮抗酶EZH2的抑制则增强再生结局。

研究人员强调，尽管p16^INK4a阳性细胞广泛与衰老和纤维化过程相关，但累积证据表明具有衰老相关特征的p16^INK4a阳性细胞的暂时积累可以通过协调免疫和基质反应在组织再生中发挥有益作用。与先前皮肤和组织修复的报道一致，研究人员观察到p16^INK4a阳性细胞在14天左右达峰，与肌腱愈合的增殖和基质沉积阶段启动相吻合。p16^INK4a阳性细胞的暂时积累不是细胞应激的简单副产品，而是时间受限的适应性程序，支持组织修复。p16^INK4a相关衰老样程序的这种双重行为——慢性时有害、暂时性有益——突出了组织修复中环境依赖性调控的重要性。

研究人员也发现JMJD3作为H3K27me3去甲基化酶这一表观遗传效应分子，在肌腱修复期间p16^INK4a阳性间充质细胞中发挥核心作用。scRNA-seq分析显示p16^INK4a阳性细胞中JMJD3显著上调，而负责H3K27me3沉积的甲基转移酶EZH2则轻微下调。这种反向调控提示p16^INK4a阳性细胞中存在全局染色质开放状态。JMJD3不仅许可ECM基因的转录，还可能调控调节免疫和内皮反应的旁分泌信号景观。相反的，JMJD3的丢失导致H3K27me3水平升高和抑制性染色质，模拟以ECM沉积失调和血管生成受损为特征的慢性纤维化状态。

研究结论总结如下：本研究的结果重新定义了p16^INK4a阳性细胞在肌腱愈合中的作用，揭示p16^INK4a阳性细胞的暂时积累通过JMJD3介导的ECM基因表观遗传重编程促进再生。鉴于p16^INK4a介导的衰老相关特征和染色质重塑是跨结缔组织的保守过程，JMJD3-H3K27me3轴可能对伤口愈合、肌肉再生和纤维化消退具有更广泛的意义。靶向该途径为设计时间特异性、表观遗传学知情的治疗策略以增强再生和防止纤维化愈合提供了有前景的途径。