阻断骨硬化蛋白第3环（loop3）与成骨细胞低密度脂蛋白受体相关蛋白4（LRP4）的相互作用，可在机械卸载期间对抗骨丢失且不增加动脉僵硬度

《Journal of Orthopaedic Translation》：Blocking interaction of sclerostin loop3 with osteoblastic LRP4 counteracts bone loss without increasing arterial stiffness during mechanical unloading

　　

背景
机械卸载可导致骨丢失和心血管去适应（cardiovascular deconditioning），并伴随骨硬化蛋白表达升高。既往研究报道，遗传性Sost敲除或药理学骨硬化蛋白抗体治疗可在小鼠中对抗机械卸载期间的骨丢失。然而，针对loop2的商业化骨硬化蛋白抗体在绝经后骨质疏松患者中曾报告严重心血管事件。因此，有必要开发一种精确的骨硬化蛋白抑制策略，以在不增加心血管风险的前提下对抗机械卸载诱导的骨丢失。

方法与结果
在既往发表于正常负载条件下的啮齿类研究中，研究人员发现骨硬化蛋白第3环（loop3）参与其对骨形成的抑制作用，而骨硬化蛋白预防心血管事件的作用独立于loop3。然而，在机械卸载条件下，骨硬化蛋白loop3是否以及如何促进骨形成降低和骨丢失，仍不清楚。本研究在机械卸载条件下发现，无论是在Sost_loop3?/?小鼠中进行骨硬化蛋白loop3特异性缺失，还是采用研究人员定制的适配体Apc001对骨硬化蛋白loop3进行特异性抑制，均可对抗卸载诱导的骨丢失，且不增加动脉僵硬度；相反，无论是Sost敲除还是罗莫佐单抗（romosozumab）治疗，均显著增加了小鼠机械卸载诱导的动脉僵硬度。这些发现提示，骨硬化蛋白loop3是一个兼具心血管安全性的、用于对抗卸载诱导骨丢失的治疗靶点。

机制上，研究人员鉴定出在机械卸载条件下，骨硬化蛋白loop3可与成骨细胞中的LRP4结合。成骨细胞特异性Lrp4敲除可在OB.Lrp4^?/?小鼠中对抗卸载诱导的骨形成降低和骨丢失。进一步研究显示，通过突变相互作用残基（Lrp4m）或应用LRP4肽工具（LRP4-Pep）进行药理学抑制，从而阻断骨硬化蛋白loop3与LRP4的相互作用，可显著减弱机械卸载条件下骨硬化蛋白与LRP6的结合，并逆转成骨细胞中Wnt/β-catenin信号活性及成骨潜能的下降。与此一致，Lrp4m在体内可对抗小鼠卸载诱导的骨形成降低和骨丢失。在Lrp4m/OB-Lrp4小鼠中，将成骨细胞中的Lrp4m条件性校正为野生型Lrp4后，Lrp4m对卸载诱导骨丢失的拮抗作用减弱。在药理学层面，靶向成骨细胞的LRP4-Pep可在野生型小鼠中对抗机械卸载期间的骨形成降低和骨丢失。

结论
骨硬化蛋白loop3介导其锚定至LRP4，可促进其在成骨细胞中与LRP6结合，从而导致机械卸载条件下的骨形成降低和骨丢失。

该文发表于《Journal of Orthopaedic Translation》，聚焦机械卸载所致骨丢失与心血管风险并存这一转化医学难题。机械卸载见于长期卧床、制动以及微重力暴露，可造成骨重塑失衡，表现为骨形成下降与骨吸收增加，并伴随动脉僵硬度升高。既往研究已提示骨硬化蛋白（sclerostin，骨细胞分泌的骨形成负调控因子）在机械刺激缺失时上调，遗传性Sost敲除或骨硬化蛋白抗体可缓解卸载性骨丢失。但临床上针对loop2的罗莫佐单抗（romosozumab）存在严重心血管不良事件警示，使“促骨形成”与“心血管安全性”之间的矛盾成为该领域核心瓶颈。基于此前在正常负载条件下的工作，研究人员提出更精准的问题：骨硬化蛋白第3环（loop3）是否是机械卸载性骨丢失的关键致病结构域，且能否在避免血管不良效应的前提下实现骨保护。

为回答这一问题，研究人员围绕“骨硬化蛋白loop3—LRP4—LRP6”轴展开系统研究。总体结论表明：在机械卸载条件下，骨硬化蛋白loop3通过与成骨细胞低密度脂蛋白受体相关蛋白4（LRP4）结合，促进骨硬化蛋白进一步结合LRP6，从而抑制Wnt/β-catenin信号通路，削弱成骨潜能并导致骨形成下降和骨丢失。更重要的是，针对loop3的特异性阻断，或者特异性阻断loop3与LRP4的相互作用，能够有效对抗卸载诱导的骨量下降、骨微结构恶化和骨力学性能减弱，同时不额外增加动脉僵硬度；而全Sost缺失或loop2导向的抗体治疗则会加重动脉僵硬。该研究因此提出了一种具有心血管安全优势的精准抗骨丢失策略，对长期卧床患者和航天员相关骨丢失防治具有重要意义。

研究所采用的关键技术方法主要包括以下几类。其一，建立小鼠后肢卸载（hindlimb unloading）模型，使用3月龄雄性小鼠，包括WT、Sost^?/?、Sost_loop3?/?、OB.Lrp4^?/?、Lrp4m及Lrp4m/OB-Lrp4等遗传模型，并结合Apc001及LRP4-Pep药理干预。其二，采用micro-CT、骨组织形态计量学与三点弯曲实验，分别评估骨量/骨微结构、动态骨形成及骨力学性能；采用多普勒超声检测脉搏波传导速度（PWV）评价动脉僵硬度。其三，在体外以随机定位机（RPM）构建机械卸载环境，结合MLO-Y4骨细胞条件培养基与MC3T3-E1成骨细胞体系，通过pull-down、共免疫沉淀（Co-IP）、共聚焦免疫荧光、TOP-Wnt荧光素酶报告、RT-qPCR、ALP染色及茜素红染色等方法解析分子机制。

2.1. Either sclerostin loop3-specific deficiency in Sostloop3?/? mice or sclerostin loop3-specific inhibition by our tailor-made aptamer Apc001 counteracted unloading-induced bone formation reduction and bone loss without increasing arterial stiffness
研究人员首先验证loop3是否参与机械卸载性骨丢失。通过后肢卸载4周后对远端股骨、近端胫骨及股骨中段进行分析发现，WT小鼠在机械卸载后出现明显骨丢失，表现为松质骨Tb.vBMD、Tb.BV/TV、Tb.Th下降，Tb.Sp升高，皮质骨Ct.Th和Ct.pMOI下降，提示骨量与骨微结构显著恶化。与WT_MUL相比，Sost^?/?_MUL和Sost_loop3?/?_MUL均显示更高的骨量参数和更优的骨微结构；Apc001处理同样改善上述指标。骨组织形态计量学进一步显示，机械卸载显著降低Tb.MAR、Tb.BFR/BS、Ct.MAR和Ct.BFR/BS，而Sost全敲除、loop3特异缺失以及Apc001干预均可恢复骨形成。三点弯曲实验显示，Sost^?/?、Sost_loop3?/?及Apc001均提升股骨极限载荷、刚度和断裂能，说明其改善了骨力学性能。心血管方面，机械卸载本身提高PWV；Sost^?/?和罗莫佐单抗进一步提高PWV，而Sost_loop3?/?与Apc001未增加PWV。该部分证明，loop3是介导卸载性骨丢失的重要结构域，但并不介导骨硬化蛋白对动脉僵硬的保护作用。

2.2. Osteoblast-specific Lrp4 knockout counteracted unloading-induced bone formation reduction and bone loss in OB.Lrp4?/? mice
为明确成骨细胞LRP4在该过程中的作用，研究人员构建了成骨细胞特异性Lrp4敲除小鼠。结果显示，在机械卸载条件下，OB.Lrp4^?/?小鼠较WT_MUL小鼠具有更高的松质骨和皮质骨骨量参数、更高的骨形成指标以及更好的骨力学表现。这说明成骨细胞LRP4参与介导机械卸载导致的骨形成下降和骨丢失，是下游关键受体之一。

2.3. Blocking interaction of sclerostin loop3 with LRP4 attenuated binding of sclerostin to LRP6, counteracted decrease of Wnt/β-catenin signaling activity and osteogenic potential in osteoblasts under mechanical unloading condition in vitro
这一部分重点解析分子机制。研究人员首先证实，在机械卸载条件下，骨硬化蛋白及其loop3可与成骨细胞中的LRP4结合。随后鉴定出LRP4上与loop3相互作用的关键残基，并据此设计Lrp4m突变工具及成骨细胞靶向LRP4阻断肽LRP4-Pep。在体外机械卸载体系中，WT成骨细胞暴露于卸载骨细胞条件培养基后，Wnt/β-catenin信号、成骨分化潜能和矿化结节形成均下降；而Sost缺失可逆转这些变化。进一步的共聚焦与结合实验显示，Lrp4m或LRP4-Pep可削弱骨硬化蛋白与LRP4结合，并进一步减弱其与LRP6的结合。功能上，Lrp4m和LRP4-Pep均提高Wnt/β-catenin信号活性，降低p-β-catenin，提升ALP和OCN表达、ALP活性及矿化能力。该部分说明，loop3与LRP4的结合并非终点，而是促进骨硬化蛋白进一步抑制LRP6/Wnt信号的“锚定”步骤。

2.4. Lrp4m (mutation of interaction residues within LRP4 to sclerostin loop3) counteracted unloading-induced bone formation reduction and bone loss in mice
在体内遗传学层面，系统性Lrp4m小鼠在机械卸载后表现出明显的骨保护效应。与WT_MUL相比，Lrp4m_MUL小鼠在远端股骨和近端胫骨松质骨以及股骨中段皮质骨均保持更高骨量和更优微结构；骨组织形态计量学显示其骨形成指标更高；三点弯曲实验显示其骨力学性能更强。该部分从遗传学上证明，破坏LRP4与骨硬化蛋白loop3的结合位点足以缓解卸载诱导的骨形成抑制和骨丢失。

2.5. In Lrp4m/OB-Lrp4 mice, osteoblast-conditional correction of Lrp4m to wild-type Lrp4 attenuated the counteractive effect of Lrp4m on unloading-induced bone loss
为了验证上述效应是否主要发生于成骨细胞，研究人员进一步构建Lrp4m/OB-Lrp4小鼠，即仅在成骨细胞中将Lrp4m校正为野生型Lrp4。结果显示，与Lrp4m_MUL相比，Lrp4m/OB-Lrp4_MUL小鼠的松质骨和皮质骨骨量参数下降，骨形成指标降低，骨力学性能减弱。也就是说，当成骨细胞恢复野生型LRP4后，Lrp4m的骨保护作用被削弱。这直接证明，loop3-LRP4相互作用在成骨细胞中对卸载性骨丢失具有决定性作用。

2.6. Osteoblasts-targeted LRP4-Pep counteracted bone formation reduction and bone loss during mechanical unloading in WT mice
在药理学转化层面，研究人员将靶向成骨细胞的LRP4-Pep以5、10、20 mg/kg每日皮下注射4周。结果显示，在WT机械卸载小鼠中，LRP4-Pep可剂量依赖性提高远端股骨和近端胫骨的Tb.vBMD、Tb.BV/TV、Tb.Th，降低Tb.Sp，同时提高股骨中段Ct.Th和Ct.pMOI。骨组织形态计量学表明，LRP4-Pep可剂量依赖性提高Tb.MAR、Tb.BFR/BS、Ct.MAR和Ct.BFR/BS。三点弯曲结果进一步显示，该肽可剂量依赖性增强股骨失效载荷、刚度和断裂能。该部分说明，直接阻断成骨细胞中loop3-LRP4相互作用具备明确的体内药理效果和潜在应用价值。

讨论部分指出，本研究在机制上补充了机械卸载致骨丢失研究链条中的下游环节。既往研究已表明Kindlin-2可作为上游机械转导调控因子，通过影响骨细胞中sclerostin表达参与骨响应；而本研究进一步揭示，当机械卸载导致sclerostin升高后，其如何通过loop3依赖方式在成骨细胞中发挥抑骨作用。与正常负载条件下主要强调sclerostin loop2与LRP5/6相互作用不同，本研究在机械卸载背景下明确指出，loop3与LRP4结合是促进sclerostin高效结合LRP6、进而抑制Wnt/β-catenin信号的关键步骤。另一方面，关于血管效应，研究显示sclerostin对抗动脉僵硬的保护作用并不依赖loop3，因此针对loop3的精准干预有望避免全局抑制sclerostin所带来的血管副作用。论文据此提出，特异性阻断成骨细胞中sclerostin loop3与LRP4的相互作用，而避免抑制loop2，可能成为一种兼顾促骨效应与心血管安全性的精准治疗策略。

研究结论部分可译为：骨硬化蛋白loop3介导骨硬化蛋白锚定于LRP4，这一过程促进其在成骨细胞中与LRP6结合，从而导致机械卸载条件下的骨形成降低和骨丢失。

总体而言，该研究的核心贡献在于将机械卸载性骨丢失的致病机制精准定位到“sclerostin loop3-LRP4-LRP6”这一分子轴，并通过遗传与药理双重证据证明：相较于广谱抑制骨硬化蛋白，针对loop3或其与LRP4的相互作用的精准阻断，不仅能够有效改善骨量、骨形成和骨强度，而且具有更好的动脉安全性。这一发现为卧床患者、失重环境暴露人群以及其他机械卸载相关骨丢失状态的干预提供了更具转化前景的理论基础与候选策略。