系统药理学揭示普济消毒饮抗日本脑炎的机制

《Journal of Pharmaceutical Analysis》：System pharmacology reveals the mechanism of Puji Xiaodu Yin against Japanese encephalitis

　　

日本脑炎（JE)是由日本脑炎病毒(JEV)引起的一种急性中枢神经系统(CNS)感染性疾病，目前缺乏特异性治疗药物。普济消毒饮(PJXDY)为中医经典方剂，常用于急性危重症治疗，但其对JE的疗效及作用机制尚不明确。本研究旨在阐明PJXDY的药理作用，筛选其代表性活性成分，并探索其潜在作用机制。研究人员通过向小鼠足垫皮下注射JEV建立JE动物模型，从生存率、行为学变化、病毒载量、炎症因子水平及组织病理学染色等方面评估PJXDY的治疗效果。采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱(UPLC-Q-TOF-MS/MS)技术鉴定进入脑组织的成分。通过系统药理学、分子对接及体外实验筛选代表性活性成分。利用药物亲和反应靶点稳定性(DARTS)、生物层干涉技术(BLI)、酶活性实验、小干扰RNA(siRNA)、蛋白质印迹(Western blot)及免疫荧光技术探索作用机制。结果显示，PJXDY可剂量依赖性地提高生存率、改善神经症状、降低病毒载量并减轻脑组织损伤。研究筛选出3个代表性活性成分：抗病毒的迷迭香酸(RA)、抗炎的金圣草素(CAA)以及抑制PANoptosis样细胞死亡的3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮(HMF)。机制研究表明，它们分别与非结构性蛋白5甲基转移酶结构域(NS5 MTase)、丝裂原活化蛋白激酶激酶1(MEK1)和Z-DNA结合蛋白1(ZBP1)相关，相应减少病毒复制、抑制炎症因子产生及降低PANoptosis相关标志物表达。三组分组合显示出与PJXDY相当的疗效。本研究为PJXDY的临床应用及现代化发展奠定了实验基础。

本研究聚焦于日本脑炎(JE)这一由日本脑炎病毒(JEV)引起的急性中枢神经系统感染性疾病。JE主要流行于东亚、东南亚、南亚及西太平洋地区，且地理分布正逐步向欧洲、澳大利亚和非洲等非流行区扩展。尽管疫苗研发取得一定进展，但由于病毒进化、气候变化、人口流动增加以及医疗资源分配不均等因素，JE的疾病负担仍未减轻。更为严峻的是，目前尚无获批的特异性抗JEV药物，临床治疗仍以支持性护理为主。传统中医药(TCM)在治疗病毒性传染病方面历史悠久，具有多组分、多靶点调控的优势，尤其适用于病毒感染合并过度炎症和细胞损伤等复杂病理过程。Puji Xiaodu Yin（PJXDY）是记载于《东垣试效方》的经典方剂，广泛应用于急性及危重症的临床治疗，但其对JE的疗效及作用机制尚不清楚，这限制了其临床应用和进一步开发。系统药理学作为系统生物学的重要分支，在连接中医药整体调控理念与现代精准分子机制研究方面发挥着关键作用，但相关发现仍需通过体内外实验加以验证。对于组成复杂的大型方剂，对所有可能的组分组合进行系统实验评估并不现实。基于此，研究人员提出"代表性活性成分"策略，即按照结构相似性将化合物分类，并通过功能筛选选取活性最强的化合物作为该类结构的代表，从而简化研究复杂度、平衡结构多样性与实验可行性。

该研究发表于《Journal of Pharmaceutical Analysis》。研究人员采用的主要关键技术方法包括：建立JEV足垫皮下感染C57BL/6J小鼠的JE动物模型；利用UPLC-Q-TOF-MS/MS鉴定PJXDY的脑组织入脑成分；基于单细胞测序数据（GSE237915）构建JE疾病靶点库；通过Swiss Target Prediction平台进行靶点预测；运用Metascape数据库进行基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析；采用分子对接技术预测化合物与靶点的结合模式；利用DARTS结合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术钓取潜在靶蛋白；通过BLI测定化合物与靶蛋白的结合亲和力；运用酶活性实验验证靶点功能；采用siRNA干扰技术验证靶点的功能性；通过Western blot、免疫荧光、 plaques实验、乳酸脱氢酶(LDH)释放实验、活/死细胞染色及末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色等方法进行表型和机制验证。

PJXDY在JEV感染小鼠模型中发挥抗病毒和抗炎作用。研究人员通过生存曲线分析发现，PJXDY以剂量依赖性方式保护小鼠抵御JEV致死性感染，高剂量PJXDY组生存率达30%，与阳性对照药物十二味薏菟散(12WYSS)的20%无显著差异。PJXDY治疗减缓了体重下降速度，显著降低脑指数，抑制脑炎症状发展并降低行为学评分。逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western blot结果显示，PJXDY显著降低脑组织中JEV的mRNA和蛋白表达水平。苏木精-伊红(H&E)染色显示，PJXDY以剂量依赖性方式减轻JEV引起的神经元损伤和炎症细胞浸润。

系统药理学预测PJXDY抗JE的关键蛋白及抗PANoptosis样细胞死亡作用。通过UPLC-Q-TOF-MS/MS分析，研究人员从PJXDY中鉴定出42个入脑成分。利用GEO数据库中的JEV感染小鼠脑组织单细胞转录组数据集(GSE237915)进行二次分析，发现JEV感染导致神经元数量减少、活化小胶质细胞和浸润性免疫细胞增加，共获得4725个差异表达基因(DEG)。将PJXDY相关靶点与JE相关基因取交集，得到118个潜在治疗靶点。GO分析显示这些靶点富集于"MAPK级联正调控"、"细胞因子产生正调控"、"炎症反应"等生物学过程；KEGG分析涉及抗病毒信号通路、MEK1相关抗炎通路以及细胞焦亡、凋亡和坏死性凋亡等多种细胞死亡方式。尤其值得注意的是，ZBP1相关PANoptosis通路显著富集。Western blot证实JEV感染显著上调脑组织中ZBP1、磷酸化混合谱系激酶结构域样蛋白(p-MLKL)、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3)及剪切型N末端GSDMD(GSDMD-N)等PANoptosis标志物的表达，而PJXDY呈剂量依赖性抑制这些标志物。免疫荧光分析显示JEV感染诱导ZBP1与RIPK3、caspase-8及凋亡相关斑点样蛋白(ASC)形成点状共定位，符合PANoptosome样结构特征，PJXDY处理显著破坏这种共定位模式。

基于关键蛋白、结构类型和体外活性筛选PJXDY的代表性活性成分。研究人员将42个入脑化合物按结构分为9类，针对JEV的E蛋白、NS3解旋酶、NS5、NS3蛋白酶以及宿主MEK1和ZBP1六个关键靶点进行分子对接，结合方剂中君臣佐使归属和结构分类，选取14个化合物进行体外活性筛选。在Neuro2a细胞抗病毒筛选中，酚酸类化合物RA在10 μM浓度下可抑制JEV表达；在BV2小胶质细胞抗神经炎症筛选中，苷类化合物CAA显示出最强的抗炎活性；在JEV感染Neuro2a细胞死亡模型中，黄酮类化合物HMF通过LDH释放实验和TUNEL染色证实具有抑制细胞焦亡、坏死性凋亡和凋亡的多重保护作用。定量分析确认RA、CAA和HMF可在JE小鼠脑组织中检测到，证明其吸收入脑并分布至病理部位。

RA通过抑制病毒NS5 MTase活性发挥抗病毒作用。时间依赖性加药实验表明，RA主要作用于JEV感染周期的胞内复制阶段。分子对接显示RA与JEV NS5 MTase的活性位点口袋结合，与阳性对照 sinefungin 具有重叠的结合模式和相当的结合能。BLI证实RA与NS5 MTase直接结合，平衡解离常数(K_D)为11.12 nM。酶活性检测显示RA在1-100 μM范围内浓度依赖性抑制MTase活性，而RA与NS3解旋酶的相互作用较弱。

CAA通过调控MEK1/ERK1/2/c-Jun/c-Fos通路发挥抗炎作用。CAA在1、3、10 μM浓度下剂量依赖性地降低JEV感染BV2细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和IL-1β的表达和分泌。Western blot显示CAA浓度依赖性抑制MEK1和细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化，进而降低转录因子c-Jun和c-Fos的表达。DARTS联合质谱鉴定MEK1为CAA保护的蛋白，BLI证实CAA与MEK1直接结合(K_D为5.752 nM)。在MEK1敲低的BV2细胞中，CAA对下游p-MEK1、p-ERK1/2、c-Jun和c-Fos的下调作用被消除，证实MEK1为CAA抗炎的功能性靶点。

HMF通过调控ZBP1/p-MLKL/Cleaved caspase-3/GSDMD-N通路发挥抗PANoptosis样细胞死亡作用。HMF改善JEV感染Neuro2a细胞的形态学损伤，浓度依赖性抑制LDH释放，减少碘化丙啶(PI)阳性细胞，降低TUNEL阳性细胞比例。Western blot显示HMF浓度依赖性抑制ZBP1表达及下游PANoptosis标志物p-MLKL、Cleaved caspase-3和GSDMD-N水平，并破坏ZBP1与RIPK3、caspase-8和ASC的共定位。DARTS联合质谱鉴定ZBP1为HMF的潜在靶蛋白，BLI验证HMF与ZBP1直接结合(K_D为27.66 nM)。ZBP1敲低消除了HMF对下游p-MLKL、Cleaved caspase-3和GSDMD-N通路的抑制作用，证实ZBP1为HMF抗PANoptosis样细胞死亡的关键靶点。

RA-CAA-HMF三组分组合在JEV感染小鼠模型中发挥综合治疗作用。高剂量RCH（100 mg/kg）实现50%生存率，与PJXDY的60%无显著差异，显著改善脑炎症状、降低行为学评分、抑制脑内病毒复制、减轻病理损伤，其抗病毒效果与PJXDY相当，并能降低TNF-α、IL-6和IL-1β等炎症因子水平。Western blot和免疫荧光显示RCH剂量依赖性降低PANoptosis标志物表达并破坏ZBP1相关蛋白共定位，与PJXDY效果相当，表明RCH构成了PJXDY抗病毒、抗炎和抗PANoptosis样细胞死亡治疗效应的主要活性基础。

在讨论部分，研究人员首先指出JE全球疾病负担沉重且缺乏特异性抗病毒药物，强调联合治疗策略的优势。虽然单药如利巴韦林体外可抑制JEV复制，但临床试验未显示获益；而免疫球蛋白、利巴韦林和干扰素-α2b的联合方案在部分患者中显示出更好结局。PJXDY作为多组分、多靶点的复方，其高剂量组在致死性JE小鼠模型中达到30%生存率，与阳性对照药12WYSS相当，但具有更明确的多靶点机制优势。RCH组合显示出与完整PJXDY方剂相当的体内疗效，提示代表性活性成分策略可有效简化大型复方的研究。研究人员还讨论了该策略的局限性，包括尚未进行正式的功能挽救实验或过表达研究、PANoptosome组装的最终验证以及HMF调控ZBP1的精确机制等，这些均有待进一步阐明。

研究结论部分指出：本研究表明PJXDY通过抑制病毒复制、缓解炎症反应和阻断神经元PANoptosis样细胞死亡，显著改善JE小鼠模型的生存率、行为学表现和神经症状。RA、CAA和HMF为其代表性活性成分，机制研究提示其分别与NS5 MTase、MEK1和ZBP1相关。三组分组合显示出与PJXDY方剂相当的疗效。这些发现表明PJXDY可能提供超越支持性护理的临床获益，包括降低急性死亡率、保留神经功能和潜在降低JE幸存者长期后遗症风险。作为具有长期临床使用历史的经典方剂，PJXDY通常被认为相对安全，有利于临床转化。本研究为PJXDY的临床应用和现代化发展奠定了实验基础。