包埋于β-乳球蛋白(β-Lactoglobulin, βLG)生物纳米空腔中的吖啶橙(Acridine Orange)和普鲁黄(Proflavin)：结合相互作用的综合光谱学与分子对接(Molecular Docking)分析

《Journal of Photochemistry and Photobiology》：Acridine Orange and Proflavin trapped in the biological nanocavity of β-Lactoglobulin: Comprehensive spectroscopic and docking analyses of the binding interactions

　　

摘要：β-乳球蛋白(β-Lactoglobulin, βLG)是食品科学研究中最为广泛研究的配体结合蛋白之一。吖啶橙(Acridine Orange, AO)和普鲁黄(Proflavin, PF)被认定为光动力疗法(Photodynamic Therapy, PDT)中具有潜力的光敏剂候选物，在生理条件下分别以质子化形式AOH+和PFH+存在。本研究通过光谱分析与分子对接分析阐明AOH+和PFH+与βLG的结合作用。圆二色(Circular Dichroism, CD)光谱研究表明AOH+比PFH+更显著地扰动βLG的二级结构。此外，荧光光谱研究提示结合相互作用具疏水性，且在特定温度下AOH+与βLG的结合强于PFH+。配体诱导的蛋白质色氨酸(Trp)荧光稳态猝灭在Stern-Volmer分析中对AOH+和PFH+均呈现向上弯曲，主要归因于静态与动态猝灭机制共存。此外，研究发现存在从蛋白质到配体的能量转移现象。研究人员利用荧光光谱数据评估了结合参数及热力学参数。分子对接结果表明两种配体均进入蛋白质的疏水β-桶(beta-barrel)区域。AOH+的显著影响可归因于其侧链甲基使其比PFH+更具疏水性。

论文解读：包埋于β-乳球蛋白生物纳米空腔中的Acridine Orange与Proflavin的结合相互作用研究

研究背景与意义

β-乳球蛋白(β-Lactoglobulin, βLG)是牛乳乳清中最丰富的蛋白质，属于脂质运载蛋白(lipocalin)超家族，因其具有中央疏水β-桶状空腔而被视为典型的小分子药物递送载体及配体—蛋白结合研究模型。吖啶橙(Acridine Orange, AO)和普鲁黄(Proflavin, PF)是潜在的抗癌光动力疗法(Photodynamic Therapy, PDT)光敏剂，在生理pH下以质子化形式AOH⁺和PFH⁺存在。目前关于这两种阳离子吖啶衍生物与βLG纳米空腔结合的光谱特征及结合模式尚缺乏系统研究。明确其与βLG的结合机制有助于理解βLG作为光敏剂载体的可行性及结构—活性关系。因此研究人员采用多光谱技术与分子对接(Molecular Docking)联用策略，探究AOH⁺和PFH⁺与βLG的相互作用机理、热力学驱动力及构象变化。该研究成果发表于《Journal of Photochemistry and Photobiology》。

主要实验方法概述

研究人员以牛源βLG（Sigma公司）及AO、PF为材料，在pH 7.4的10 mM Tris-HCl缓冲液中配制溶液。采用圆二色(Circular Dichroism, CD)光谱（Jasco J-815，190–250 nm，1 mm光程）检测βLG二级结构变化并计算α-螺旋含量；利用稳态荧光光谱（Horiba Jobin Yvon Fluoromax-3，λ_ex=280 nm，内滤光效应校正）进行Stern-Volmer猝灭分析及结合常数计算，并结合时间分辨荧光寿命测试（TCSPC，λ_ex=295 nm）区分静态与动态猝灭及F?rster共振能量转移(F?rster Resonance Energy Transfer, FRET)参数；通过紫外—可见吸收光谱确认基态复合物形成；使用AutoDock Vina对20个经质量筛选的βLG晶体结构进行盲对接(blind docking)，网格盒48 ? × 48 ? × 48 ?，分析配体在β-桶疏水空腔内的结合姿态、结合能及残基相互作用。

研究结果

3.1. CD Spectroscopy（圆二色光谱）

在远紫外区记录βLG（16 μM）加入递增浓度AOH⁺（90、275 μM）和PFH⁺（275、475 μM）后的CD光谱。游离βLG在215 nm附近呈负峰，代表β-折叠特征。加入配体后负椭圆度降低，表明β-折叠含量下降。依据MRE₂₂₂计算的α-螺旋含量显示，游离βLG为15.23%，加275 μM AOH⁺降至2.37%，加475 μM PFH⁺降至7.82%。结论：AOH⁺比PFH⁺对βLG二级结构的扰动更显著，引起β-折叠减少及α-螺旋丢失。

3.2. Fluorescence Spectroscopy（荧光光谱学）

βLG固有荧光（λ_em=340 nm，源于Trp 19与Trp 61，其中Trp 19贡献约80%）随AOH⁺或PFH⁺浓度增加而被猝灭，且配体自身荧光增强，出现等发射点（AOH⁺体系450 nm，PFH⁺体系440 nm）。Stern-Volmer图呈向上弯曲，时间分辨荧光寿命随配体浓度增加而缩短（平均寿命由~2.25 ns分别降至最低1.72 ns及1.79 ns），同时配体吸收光谱出现减色效应无位移——综合证实猝灭为静态（基态复合物形成）与动态（激发态扩散碰撞）猝灭共存机制。FRET计算显示供体(βLG)—受体(配体)距离r分别为52.93 ?（AOH⁺）和55.08 ?（PFH⁺），均在0.5R₀～1.5R₀范围内，能量转移效率E分别为0.24和0.18，证实发生从βLG至配体的单线态能量转移。通过log[(F₀-F)/F]–log[Q]求得结合位点数n≈1.3–1.8，结合常数K_A随温度升高而增大（298 K时AOH⁺-βLG为3.09×10⁶M^-1，PFH⁺-βLG为1.58×10⁶M^-1）。热力学参数ΔH⁰>0、ΔS⁰>0（AOH⁺体系ΔH⁰=114.98 kJ·mol^-1，ΔS⁰=513.06 J·mol^-1·K^-1；PFH⁺体系ΔH⁰=86.46 kJ·mol^-1，ΔS⁰=411.34 J·mol^-1·K^-1），ΔG⁰<0，表明结合自发进行且主导作用力为疏水相互作用(Hydrophobic interaction)；AOH⁺因带有两个侧链甲基而疏水性更强，故结合常数高于PFH⁺。

3.3. Molecular Docking（分子对接）

对20个βLG晶体结构实施盲对接，按结合位点分为经典(canonical, 即已知β-桶内疏水空腔)与非经典(non-canonical, 表面结合)。两种配体均以经典模式进入β-桶中央疏水空腔，腔内衬有Ile28、Val31、Leu55、Val57、Val59、Leu62、Leu70、Ile72、Leu74、Ile87、Phe98、Ile100、Val108、Val110、Leu119、Phe121、Met123、Leu138等疏水残基。Phe121与配体发生π-π堆积及阳离子—π(cation-π)相互作用。腔内Trp 35（UniProt编号，对应晶体学Trp 19）距配体约10.3 ?，溶剂暴露的Trp 77（对应Trp 61）约17.3 ?。经典结合簇的平均对接结合能：PFH⁺为-34.77±0.83 kJ/mol，AOH⁺为-32.79±0.90 kJ/mol，与实验结合自由能趋势相符。结论：分子对接证实了光谱学推断——两配体均定位于βLG疏水β-桶空腔并以疏水作用为主，AOH⁺因额外甲基增强疏水匹配度而表现出更强的实验结合亲和力。

讨论与结论翻译

研究表明βLG可结合多种配体。本工作通过光谱结合分子对接阐明了两种PDT光敏剂AOH⁺和PFH⁺与βLG的结合机理：CD光谱表明AOH⁺比PFH⁺更明显地改变蛋白质二级结构；稳态荧光Stern-Volmer图向上弯曲主要源于静态与动态猝灭共存，且发生从βLG至配体的F?rster共振能量转移；结合常数分析显示同温下AOH⁺结合强于PFH⁺，热力学参数ΔH⁰>0、ΔS⁰>0表明为疏水驱动的自发结合；分子对接证实两配体进入βLG疏水β-桶区域，AOH⁺因含侧链甲基而疏水性更高，利于与蛋白质疏水腔作用。与前期含酮羰基的Acridone(AD)—βLG体系（以氢键作用为主、荧光寿命延长）相比，本研究中AOH⁺和PFH⁺—βLG体系为纯疏水作用且荧光寿命缩短，说明同一母核药物功能团的合理选择可调控其与同一载体蛋白的相互作用模式。该研究为βLG作为疏水性光敏剂纳米载体的设计提供了实验与理论依据。