金属-原卟啉IX作为工程化光响应蛋白潜在光敏剂的表征

《Journal of Photochemistry and Photobiology》：Characterization of Metal-Protoporphyrins as Potential Photosensitizers for Engineered Photoresponsive Proteins.

　　

金属-原卟啉IX（PpIX）为工程化光响应蛋白（EPrPs）的构建提供了多功能平台，然而其与蛋白质相互作用后的光物理和光化学性质尚未得到充分表征。研究人员 herein 研究了三种PpIX类似物——MgPpIX、ZnPpIX和MnPpIX——在水溶液中以及与重组人血清白蛋白（rHSA）自组装后的光谱学、激发态性质和激光诱导光化学。利用稳态吸收和荧光光谱、时间相关单光子计数（TCSPC）以及单线态氧（¹O₂）传感，研究人员证明每种金属卟啉均表现出独特的光化学机制。MgPpIX发生显著光漂白并形成光产物，但受少量然而在光谱学上显著的金属游离PpIX（mfPpIX）的影响。ZnPpIX以单体形式结合rHSA，表现出显著光漂白且无可检测的光产物或增强的单线态氧生成，表明其遵循非II型光敏化途径。相比之下，MnPpIX表现为d型超卟啉（hyperporphyrin）：其与rHSA的相互作用较弱，且光漂白可忽略，这与分子内电荷转移（LMCT）态主导的弛豫机制一致。综上，这些结果建立了将金属配位与蛋白质结合、激发态动力学及光化学结果相联系的机制框架。MgPpIX、ZnPpIX和MnPpIX不同的反应性特征凸显了它们作为可调辅因子用于具有定制光化学功能的EPrPs的潜力。

在生物体中，光响应蛋白（PrPs）如光受体是专精于光机械能量转换的复杂生物分子机器，在将光子能量转化为驱动生化过程方面发挥着基础性作用。从细菌到人类，这些生物分子介导着视觉感知、生长发育和环境响应等关键生命过程。PrPs的核心在于其生色团辅因子——即光敏剂（PS）——与脱辅蛋白在特定位点结合或偶联。PS的光学激发触发异构化、电荷转移或裂解等光物理或光化学过程，进而引起蛋白质构象变化并激活信号级联，最终实现生物学功能。天然PrPs的优雅高效机制为工程化功能生物材料的设计提供了诱人模板，通过理性改造光响应机制，可使原本不具备光反应性的脱辅蛋白获得新功能。将PS与非光响应性脱辅蛋白组装，可构建出功能性受光调控的工程化光响应蛋白（EPrPs），应用于光遗传学、光控药物递送系统及光开关催化剂等领域。然而，工程化PrPs面临重大挑战，包括PS在脱辅蛋白中的精确定位、光物理或光化学机制的选择，以及将该机制与蛋白质独特构象变化相匹配等，这些因素均需深入的基础机制理解方能有效开发EPrPs。

卟啉类化合物作为PS具有诸多优势：易于与多种蛋白质结合、相对充分表征且多数具有生物相容性。其中，原卟啉IX（PpIX）家族因其不对称结构（C2和C18位含两个丙酸基团，C7和C12位含两个乙烯基）而备受关注。该家族包括金属游离前体（mfPpIX）及多种中心配位金属的金属卟啉（metallo-PpIX）。金属配体通过调节激发态电子分布来调控光学响应和光物理机制，这一特性由Gouterman四前沿轨道模型及其后续Wamser的修正所阐释，据此可将卟啉分类为正常型、超型和高位型（hypso）。结构相似但激发态特性不同的PS尤为可贵，因其可在脱辅蛋白相同位点实现光敏化机制的金属依赖性调控，从而构建结构相似但功能迥异的EPrPs。

基于此前对mfPpIX（正常型）、血红素（hemin，d型超卟啉）和SnPpIX（p型超卟啉）与rHSA相互作用的研究结果，研究人员进一步探究了另外三种PpIX类似物作为EPrPs潜在PS的可行性：两种"正常"卟啉（ZnPpIX和MgPpIX）以及一种d型超卟啉（MnPpIX）。

本研究采用的关键技术方法包括：稳态紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）、稳态荧光光谱（含荧光发射光谱和荧光激发光谱）、时间相关单光子计数（TCSPC）荧光寿命测量，以及利用单线态氧传感器绿（SOSG）检测¹O₂生成；激光光源为405 nm激光二极管，照射条件包括空气饱和及氮气惰性气氛。样本来源为商业购买的rHSA及三种金属卟啉。

**3.1 MgPpIX（正常型）**

**3.1.1 紫外-可见吸收光谱**

无rHSA时，MgPpIX水溶液显示宽化的Soret带（~373 nm）及肩峰（~467 nm），Q带位于537、562、590和642 nm，提示卟啉寡聚化；加入rHSA后，出现清晰的Soret带（~414 nm）及四个Q带（507、546、586、631 nm），蓝移显著，表明rHSA诱导单体化。据估算约45%的rHSA分子与MgPpIX单体形成复合物。激光照射后，无rHSA样品光漂白轻微；含rHSA样品Soret带强度降至初始值的~40%，差谱显示负带从423 nm移至419 nm，正带在~455 nm增长，且>630 nm处出现新带（~665 nm），提示光产物形成，但无清晰等吸收点表明非简单两态转化。惰性气氛下光漂白减弱（保留~85%），残余漂白归因于氧气未完全去除。

**3.1.2 荧光光谱**

无rHSA时，MgPpIX发射峰位于589、622和681 nm；结合rHSA后峰位红移至601、636、700 nm，强度增加26倍。基于文献对照及高斯拟合分析，研究人员判定样品含有显著比例的mfPpIX杂质（可能源于不完全金属螯合），后者在622 nm和681 nm的发射中占主导。激光照射后，无rHSA样品中589 nm峰（归属MgPpIX）消失，650 nm组分倍增，提示MgPpIX光产物；含rHSA样品中602 nm和636 nm峰消失，被649 nm和673 nm光产物取代，后者与mfPpIX光产物一致。

**3.1.3 荧光寿命衰变**

无rHSA时，衰变需三指数拟合，平均寿命11.9 ns；rHSA存在时增至14.5 ns（636 nm检测），但602 nm检测仅为10.1 ns，支持两物种共存判断。激光照射使rHSA复合物平均寿命减半，中间寿命组分贡献增>20倍，长寿命组分贡献减>30%。

**3.1.4 单线态氧生成**

SOSG检测显示，MgPpIX-rHSA体系的¹O₂光敏化初速率（0.70±0.05 cm²·J^?1）显著高于卟啉单独（0.09±0.03）或SOSG单独（0.12±0.04），表明单体卟啉结合rHSA后¹O₂光敏化效率提升逾7倍。但因mfPpIX共存，无法完全区分两种卟啉各自贡献。

**3.2 ZnPpIX（正常型）**

**3.2.1 紫外-可见吸收光谱**

无rHSA时，ZnPpIX显示宽Soret带（350 nm和399 nm组分共存）及两个Q带，提示单体与寡聚体共存；rHSA存在下出现417 nm新组分（蛋白质结合态），约56% rHSA与ZnPpIX结合。Soret带红移与Q带蓝移的组合表明蛋白质结合改变了卟啉构型或金属配位状态。激光照射后，无rHSA样品光漂白有限（399 nm组分仅降4%）；含rHSA样品417 nm组分光漂白达~75%，但无>600 nm光产物吸收带出现，提示不同于传统光敏化机制。

**3.2.2 荧光光谱**

无rHSA时ZnPpIX荧光极弱；rHSA使其发射增强14倍，峰位（590、643 nm）却保持不变，表明ZnPpIX偶极矩小、对环境变化不敏感。激发光谱从403 nm（无rHSA）移至411 nm（有rHSA），暗示激发途径因结合而异。激光照射后，rHSA复合物发射强度降>85%，但无新发射峰出现。

**3.2.3 荧光寿命衰变**

衰变由双指数拟合最优，寿命组分本身不受rHSA影响，仅相对贡献变化：rHSA存在时亚纳秒散射组分减少，平均寿命从0.57 ns增至1.84 ns。激光照射后需引入第三组分（~4.8 ns，<20%贡献），但无稳态光谱对应物。

**3.2.4 单线态氧生成**

ZnPpIX单独及与rHSA复合的¹O₂光敏化速率（0.15±0.02和0.17±0.01 cm²·J^?1）与SOSG基线相当，惰性气氛下半数降低，表明存在不依赖¹O₂的光敏化途径，可能涉及电荷转移机制。

**3.3 MnPpIX（d型超卟啉）**

**3.3.1 紫外-可见吸收光谱**

MnPpIX呈现典型d型超卟啉"分裂"Soret带（~365 nm和~465 nm），rHSA引起轻微峰位移动（1 nm红移/3 nm蓝移），但变化甚微，提示结合微弱或光谱特征不受结合影响。激光照射几乎不引起光漂白，无论有无rHSA，与血红素行为相似，符合LMCT主导弛豫的超卟啉模型预测。

**3.3.2 荧光光谱**

MnPpIX本身荧光极弱（d型超卟啉预期无荧光），检测到的621 nm（无rHSA）及636/700 nm（有rHSA）发射与mfPpIX一致，提示微量mfPpIX杂质。激光照射rHSA复合物后，636 nm峰移至649 nm，强度降~60%，与mfPpIX光产物特征吻合。

**3.3.3 荧光寿命衰变**

仅能在含rHSA样品中记录到衰变：亚纳秒散射组分（86%）和~14 ns长寿命组分（14%），后者归因于微量mfPpIX。

**3.3.4 单线态氧生成**

MnPpIX的¹O<sub>2光敏化速率（单独0.09±0.01，复合物0.13±0.01 cm²·J^?1）不高于SOSG基线，表明无显著¹O2生成，光诱导效应可能涉及LMCT途径。

**讨论总结**

三种PS展现出显著差异，对其EPrPs应用具有重要启示。即使无蛋白质存在，三者溶解度均优于以往研究的对应物。MgPpIX和ZnPpIX与rHSA形成明确复合物，而MnPpIX如同前期研究的血红素，未表现出显著蛋白质结合或光谱特征受结合影响。延长孵育时间至12小时未改变此结果。

MgPpIX和MnPpIX的荧光信号受mfPpIX"污染"，但仍可得出若干结论。MgPpIX-rHSA体系的光敏化可能由mfPpIX污染物主导，后者不仅自身与¹O2反应，还可能介导MgPpIX的光产物形成。MnPpIX中mfPpIX相对量过小，无法产生显著光敏化效应，尽管其荧光信号由该杂质主导。

ZnPpIX作为EPrPs的PS尤为引人注目。在所有研究的PpIX中，ZnPpIX独特地表现出显著光漂白却无检测光产物、且无增强¹O2生成。此前仅mfPpIX（正常型）和SnPpIX（p型超卟啉）展示典型PS特征（光漂白、光产物形成、¹O2敏化）。ZnPpIX是首个观察到显著光漂白却无伴随光产物或¹O2的PS，且与mfPpIX类似能有效结合rHSA，而与SnPpIX不同。这提示可工程化两种功能不同的EPrPs：mfPpIX通过扩散性¹O2在远端修饰蛋白质宿主，ZnPpIX则通过局域化机制实现。该替代机制的性质正通过高级计算和实验方法深入研究。

MgPpIX同样具有潜力，其与ZnPpIX结果相似，但因无法从mfPpIX杂质中分离其贡献，暂难定论。MnPpIX虽不显著结合rHSA或进行环境光敏化，但其LMCT途径可能作为不同的光敏化触发器用于蛋白质构象变化；其水溶性优于血红素，在其他实验条件或不同蛋白质靶标下可能更具应用潜力。

**研究结论翻译**

本研究系统表征了MgPpIX、ZnPpIX和MnPpIX三种金属-原卟啉IX的光物理和光化学性质，建立了金属配位类型与蛋白质结合、激发态动力学及光化学结果之间的机制联系。结果显示：（1）MgPpIX与rHSA结合后发生显著光漂白和光产物形成，但受mfPpIX杂质干扰；（2）ZnPpIX以单体形式结合rHSA，展现独特光漂白特征却无检测光产物或¹O2生成，提示非II型光敏化途径；（3）MnPpIX作为d型超卟啉，与rHSA结合微弱且光活化性可忽略，LMCT态主导其弛豫。三种卟啉不同的反应性特征凸显其作为可调辅因子用于定制光化学功能EPrPs的潜力，该论文发表于《Journal of Photochemistry and Photobiology》。</sub>