《Histopathology》：Diagnostic utility of inflammatory markers in formalin-fixed and paraffin-embedded muscle biopsies for idiopathic inflammatory myopathies
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本研究旨在建立一种可重复性的免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC)方法，用于福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed, paraffin-embedded, FFPE)肌肉组织切片，并评估其在无法获取快速冷冻肌肉活检标本的
本研究旨在建立一种可重复性的免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC)方法，用于福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed, paraffin-embedded, FFPE)肌肉组织切片，并评估其在无法获取快速冷冻肌肉活检标本的情况下，对特发性炎症性肌病(idiopathic inflammatory myopathies, IIM)的诊断应用价值。研究人员分析了20例病例：皮肌炎(dermatomyositis, DM)(n=5)、包涵体肌炎(inclusion body myositis, IBM)(n=2)、免疫介导坏死性肌病(immune-mediated necrotizing myopathy, IMNM)(n=5)、重叠性肌炎(overlap myositis, OM)(n=1)、未分类肌病(n=3)、线粒体肌病(n=1)、LGMD R2 dysferlin相关肌营养不良症(n=1)、面肩肱型肌营养不良症(n=1)以及神经源性肌改变(n=1)。对3 μm厚的FFPE肌肉切片进行免疫组织化学染色，采用柠檬酸盐/乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液进行热诱导抗原修复，并在4°C条件下与主要组织相容性复合体I类(major histocompatibility complex class I, MHC-I)、主要组织相容性复合体II类(major histocompatibility complex class II, MHC-II)、膜攻击复合物(membrane attack complex, MAC)、黏液病毒抗性蛋白A(myxovirus resistance protein A, MxA)及p62抗体过夜孵育。同时，对冷冻切片进行平行分析以供比较。
FFPE肌肉切片中MHC-II、MxA和p62的染色强度和模式与冷冻切片相当。尽管在8例病例中观察到冷冻与FFPE切片之间存在差异，但每例仅涉及单一标志物，且MHC-II(P=0.4795)、MxA(P=0.4795)和p62(P=0.6171)的免疫组织化学结果未显示统计学显著差异。两种方法之间的一致性较高，MHC-II和MxA达到90%，p62达到80%。这些孤立的不一致可能反映了IIM特征性的节段性和斑片状抗原表达变异所致。然而，MHC-I和MAC染色在FFPE切片中未能成功实现。
FFPE肌肉切片中成功实现了MHC-II、MxA和p62的免疫标记。这些发现表明，多种对IIM具有诊断价值的标志物可在FFPE肌肉组织中可靠评估，为资源受限环境提供了一种实用的诊断选择。
## 研究背景与问题提出
特发性炎症性肌病(idiopathic inflammatory myopathies, IIM)是一组以肌肉炎症和进行性肌无力为特征的免疫介导性肌肉疾病。近年来，国际学界已将IIM重新细分为五种明确亚型，包括皮肌炎(dermatomyositis, DM)、包涵体肌炎(inclusion body myositis, IBM)、免疫介导坏死性肌病(immune-mediated necrotizing myopathy, IMNM)、抗合成酶综合征和重叠性肌炎(overlap myositis, OM)。值得注意的是，多发性肌炎(polymyositis)这一传统诊断正逐渐被重新归类，现已视为过时的诊断实体。临床信息、自身抗体谱和肌肉活检是IIM诊断的三大支柱。其中，快速冷冻肌肉活检被视为金标准，因其能有效保存酶活性和组织抗原性，这对准确的组织病理学评估至关重要。然而，冷冻肌肉活检在资源受限地区的可及性严重不足，成为制约及时准确诊断的重大瓶颈。以泰国为例，全国77个省份中，仅曼谷少数几家三级医院能提供此项服务，这极大限制了患者获得及时诊断和适当治疗的机会。
相比之下，基于福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed, paraffin-embedded, FFPE)肌肉组织的免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)技术具有更广泛的普及性。此前，研究人员已成功利用FFPE肌肉组织开发出检测肌营养不良相关蛋白的可靠IHC方法。在此基础上，本研究旨在进一步克服IIM诊断中的类似局限，建立针对FFPE肌肉样本中炎症标志物的敏感且可重复的IHC检测方法，使其性能可与冷冻技术相媲美。研究聚焦于主要组织相容性复合体I类(major histocompatibility complex class I, MHC-I)、MHC-II、膜攻击复合物(membrane attack complex, MAC或C5b-9)、黏液病毒抗性蛋白A(myxovirus resistance protein A, MxA)和p62，这些标志物分别可揭示异常MHC表达、补体沉积、I型干扰素活性和自噬空泡等关键病理改变。
本研究纳入20例经临床、组织病理学和快速冷冻肌肉组织免疫表型分析确诊的病例，涵盖DM(n=5)、IBM(n=2)、IMNM(n=5)、OM(n=1)、未分类肌病(n=3)、线粒体肌病(n=1)、LGMD R2 dysferlin相关肌营养不良症(n=1)、面肩肱型肌营养不良症(n=1)及神经源性肌改变(n=1)。肌肉活检标本取自股四头肌或肱二头肌，每份标本均分为两部分：一部分进行快速冷冻处理，另一部分以10%中性缓冲福尔马林固定并制成石蜡块。FFPE切片厚度为3 μm，经脱蜡水化后，先后于97°C柠檬酸盐缓冲液和EDTA缓冲液中进行热诱导抗原修复各20分钟，经内源性过氧化物酶阻断和非特异性背景封闭后，与相应一抗在4°C过夜孵育。采用自动化染色平台完成后续显色步骤。冷冻对照切片为10 μm厚，未经固定和抗原修复直接染色。所有结果由研究人员独立盲法判读，免疫反应性强度分为阴性(–)、弱阳性(+)、中度(++)和强阳性(++++)四级，最终结合临床信息进行诊断解读。
## 主要技术方法
本研究采用的关键技术方法包括：(1)配对样本设计，同一份肌肉活检标本同时制备冷冻和FFPE两种切片；(2)针对FFPE组织的热诱导抗原修复技术，采用柠檬酸盐/EDTA顺序修复策略；(3)免疫组织化学，检测MHC-I、MHC-II、MAC、MxA和p62五种标志物；(4)McNemar检验用于比较两种方法间的一致性，设定P<0.05为统计学显著；(5)样本来源于泰国曼谷拉玛提博迪医院(Human Research Ethics Committee, Faculty of Medicine, Ramathibodi Hospital, Mahidol University批准)的生物库组织。
## 研究结果
**MHC-II、MxA和p62在FFPE组织中成功显色**
研究确定了FFPE切片的优化抗体工作浓度：MHC-II为1:50，MxA为1:200，p62为1:200。相反，即使稀释至1:50，MHC-I和MAC在FFPE切片中仍无法显色。在20例病例中，12例(60%)的MHC-II、MxA和p62染色在两种组织中完全等效。代表性病例显示：IBM病例中，FFPE切片呈现强MHC-II表达和p62阳性聚集伴MxA阴性，符合IBM典型免疫表型；DM病例中，FFPE切片显示束周萎缩伴MxA和p62阳性、MHC-II阴性；IMNM病例中，FFPE切片显示MHC-II、MxA和p62共同表达，均与冷冻切片一致。
**冷冻与FFPE切片的不一致病例分析**
8例病例(40%)出现单一标志物的不一致，但未达到统计学显著水平。具体包括：MHC-II不一致2例(Case 5幼年DM冷冻阳性/FFPE阴性；Case 8 IMNM冷冻阴性/FFPE阳性)；MxA不一致2例(Case 3 DM冷冻阴性/FFPE阳性；Case 12 IMNM冷冻阳性/FFPE阴性)；p62不一致4例(Case 2 DM和Case 15未分类肌病冷冻阴性/FFPE阳性；Case 9 IMNM和Case 20神经源性改变冷冻阳性/FFPE阴性)。经复核存档冷冻切片确认原结果可靠。研究人员认为这些不一致反映了IIM特征性的节段性和斑片状抗原表达，以及不同切割平面导致的抽样变异，而非技术误差。
**统计学分析与一致性评估**
McNemar检验显示，MHC-II(P=0.4795)、MxA(P=0.4795)和p62(P=0.6171)在两种组织间均无统计学显著差异。总体一致性高：MHC-II和MxA达90%，p62达80%。各IIM亚型中标志物阳性率在两种组织间分布相似，仅存在小幅变异。
## 讨论与结论
研究人员深入分析了FFPE组织在IIM诊断中的价值与局限。从病理机制角度，MxA作为I型干扰素诱导蛋白，在DM中的表达具有重要诊断意义。本研究中Case 3在FFPE切片中检测到冷冻切片遗漏的束周MxA阳性，这与DM中MX1基因表达显著升高(约280倍于正常肌肉)的分子证据相符，凸显了FFPE技术检测I型干扰素相关改变的稳健性。MHC-II在IIM中的特异性优于MHC-I，既往研究显示MHC-I在98%的IIM和93%的非IIM中均有表达，而MHC-II在IIM中的阳性率为62%，非IIM中仅10%。因此，尽管MHC-I在FFPE中未能成功显色，MHC-II可作为一种可靠的替代标志物。
在IBM诊断中，弥漫性MHC-II表达和p62聚集体在FFPE中保存良好，足以支持诊断。既往报道MHC-II在IBM中的阳性率高达96%-100%。值得注意的是，p62在IBM中的积累更可能源于降解障碍而非合成增加，其mRNA水平实际上是降低的。MxA在IBM中 consistently 阴性，与本研究结果一致，这有助于排除DM诊断。
对于IMNM，MHC-II表达在FFPE中的检出率(40%)与既往报道的17%-44%相符，MxA表达稀少，与缺乏显著I型干扰素激活的病理特征一致。p62在各IIM亚型中均高度表达，但需强调其反映的是肌纤维应激和退行性改变，而非疾病特异性标志物。
MAC染色在FFPE中的失败符合其仅验证用于冷冻切片的局限性。考虑到MxA具有更高的敏感性(71% vs. 35%)和相当的特异性(98% vs. 93%)，且技术可行性更优，MxA可作为MAC的实用替代标志物用于FFPE标本的DM评估。
研究进一步指出，FFPE组织具有切片更薄(3 μm vs. 冷冻切片10 μm)、形态学分辨率更佳、便于长期存档等优势，这与血液病理学领域从依赖冷冻组织到常规使用FFPE标本的历史转变相似。多种炎症标志物如CD3、CD20、CD4、CD8、CD56和CD68已确立可用于FFPE组织，本研究则进一步扩展了FFPE在肌肉病理中的应用谱。
研究结论指出：FFPE肌肉活检切片能够在大多数IIM病例中可靠显示MHC-II、MxA和p62的免疫组织化学染色，与冷冻切片具有高度一致性。鉴于两种方法间无统计学显著差异，FFPE免疫组织化学为资源有限环境提供了实用替代方案，可在不损害诊断完整性的前提下促进准确诊断。未来需进一步标准化FFPE方案、扩展标志物组合，并开展更大规模研究以精确评估FFPE相对于冷冻切片的标志物特异性敏感性和特异性。
