肉桂(Cinnamomum cassia)树皮中纯化多糖的结构表征及其降血糖效应

《Food Science & Nutrition》：Structural Characterization and Hypoglycemic Effects of a Purified Polysaccharide From Cinnamomum cassia

　　

研究人员从肉桂(Cinnamomum cassia)树皮中经超声辅助复合酶提取及DEAE-52和Sephadex G-100柱层析分离得到一种纯化多糖，命名为CCP1A。CCP1A分子量(Mw)为8.161 kDa，主要由葡萄糖(glucose)和半乳糖醛酸(galacturonic acid, GalA)组成，含少量鼠李糖(rhamnose, Rha)、阿拉伯糖(arabinose, Ara)、半乳糖(galactose, Gal)、木糖(xylose, Xyl)和甘露糖(mannose, Man)。光谱分析(傅里叶变换红外光谱FT-IR和1H核磁共振NMR)证实其同时存在α-和β-糖苷键及吡喃糖环结构。刚果红(Congo red)实验表明其具稳定螺旋构象，透射电镜(TEM)显示其为树枝状卷曲聚集体。在高脂饮食联合低剂量链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导的2型糖尿病(type 2 diabetes, T2D)小鼠模型中，连续4周每日灌胃CCP1A(100、200和300 mg/kg)可剂量依赖性地降低空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)，改善糖耐量(oral glucose tolerance test, OGTT)和血脂谱(甘油三酯TG、总胆固醇TC、低密度脂蛋白胆固醇LDL-C和高密度脂蛋白胆固醇HDL-C)，缓解多饮(polydipsia)、多食(polyphagia)、体重减轻及胰腺病理损伤。机制上，CCP1A抑制肠道α-淀粉酶(α-amylase)和α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)活性，促进肝和肌糖原合成，上调肝中葡萄糖激酶(glucokinase, GCK)、葡萄糖转运蛋白2(glucose transporter 2, GLUT2)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositol 3-kinase, PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)及核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)的mRNA表达，下调磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK) mRNA表达，升高血清总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase, CAT)和总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)，降低丙二醛(malondialdehyde, MDA)和糖化血清蛋白(glycated serum protein, GSP)水平。上述结果表明CCP1A通过抑制肠道葡萄糖吸收、调节胰岛素信号相关基因、促进糖原合成、抑制糖异生及上调Nrf2 mRNA发挥多靶点降血糖作用，是开发抗T2D功能性食品的有前景天然候选物。

论文解读：《Structural Characterization and Hypoglycemic Effects of a Purified Polysaccharide From Cinnamomum cassia》发表于《Food Science & Nutrition》(或同级别食品科学与营养学期刊)

研究背景与目的

2型糖尿病(type 2 diabetes, T2D)以胰岛素抵抗和β细胞功能进行性衰退为特征，慢性高血糖诱发的氧化应激是糖尿病并发症的关键介质。一线降糖药如二甲双胍和α-葡萄糖苷酶抑制剂虽有效，但长期使用常引起胃肠道不良反应。肉桂(Cinnamomum cassia)为药食同源资源，其水溶性多糖被认为是主要活性成分，但现有研究多集中于粗多糖的体外活性筛选，缺乏高度纯化、结构明确的多糖在体内对T2D整体代谢表型及器官病理损伤的剂量依赖性和系统性机制阐释。为此，研究人员提取、纯化并系统表征肉桂多糖CCP1A，并在高脂饮食联合低剂量链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导的T2D小鼠模型中综合评价其体内降糖、调脂、抗氧化及分子调控效应。

主要关键技术方法

研究人员取市售肉桂树皮，经脱脂、超声辅助复合酶(纤维素酶:果胶酶:木瓜蛋白酶=8:1:1)提取、乙醇沉淀得粗多糖(crude Cinnamomum cassia polysaccharide, CCP)；粗多糖经三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)脱蛋白、AB-8大孔吸附树脂脱色、DEAE-52纤维素柱(梯度NaCl洗脱)和Sephadex G-100凝胶柱层析纯化获得CCP1A。采用蒽酮-硫酸法测总糖、考马斯亮蓝法测蛋白、硫酸-咔唑法测糖醛酸含量；紫外全波长扫描(200–600 nm)检测核酸/蛋白残留；离子色谱法(ion chromatography, IC)分析单糖组成；凝胶渗透色谱-多角度激光光散射-示差折光检测(gel permeation chromatography coupled with multi-angle laser light scattering and refractive index detection, GPC-MALLS-RI)测定分子量及分布；傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)分析官能团；刚果红(Congo red)实验检测螺旋构象；¹H核磁共振(nuclear magnetic resonance, ¹H NMR)分析糖苷键构型；透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)观察微观形貌。体内实验选用SPF级雄性昆明(Kunming)小鼠，高脂饮食喂养4周后腹腔注射STZ(40 mg/kg/d × 5 d)造T2D模型(FBG ≥ 16.7 mmol/L)，随机分为模型对照组、阳性药组(二甲双胍200 mg/kg + 阿卡波糖10 mg/kg)及CCP1A低(100 mg/kg)、中(200 mg/kg)、高(300 mg/kg)剂量组，每日灌胃干预4周，监测体重、摄食量、饮水量、空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、口服糖耐量(oral glucose tolerance test, OGTT)；末次给药后取血清测血脂、肝功能(丙氨酸氨基转移酶ALT、天冬氨酸氨基转移酶AST)、氧化应激指标(总超氧化物歧化酶T-SOD、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px、过氧化氢酶CAT、丙二醛MDA、总抗氧化能力T-AOC、糖化血清蛋白glycated serum protein GSP)；取肝测糖原含量，取小肠测α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性；胰腺行苏木精-伊红(hematoxylin–eosin, HE)染色；肝组织提取RNA行实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)检测葡萄糖激酶(glucokinase, GCK)、葡萄糖转运蛋白2(glucose transporter 2, GLUT2)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositol 3-kinase, PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)、核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2) mRNA表达。

研究结果

4.1 Analysis of the Chromatographic Purification Process of CCP1A

经DEAE-52离子交换层析得0.3 mol/L NaCl洗脱主峰组分CCP1，再经Sephadex G-100凝胶过滤得单一对称洗脱峰，合并冻干得纯化多糖CCP1A，表明其均一性好。

4.2 Structural Analysis

纯度89.41% ± 0.95%，蛋白含量1.27% ± 0.11%，糖醛酸含量23.46% ± 0.21%。紫外扫描无260 nm和280 nm吸收峰，证实核酸与蛋白已有效去除。单糖摩尔比为Rha:Ara:Gal:Glc:Xyl:Man:GalA:GlcA = 2.77:2.52:8.81:114.85:1.00:1.97:28.00:1.37，葡萄糖(约71.7%)和半乳糖醛酸(约17.5%)为主，属富含葡萄糖和糖醛酸的杂多糖，具高比例线性同型半乳糖醛酸(homogalacturonan, HG)域及RG-I区高度分支侧链。GPC-MALLS-RI测得数均分子量(M_n) 6.198 kDa，重均分子量(M_w) 8.161 kDa，Z均分子量(M_z) 15.137 kDa，多分散指数(M_w/M_n) 1.317。FT-IR在3275 cm^?1(?OH伸缩)、2925 cm^?1(C?H伸缩)、1241–1015 cm^?1(C?O?C及C?O?H指纹区)、921 cm^?1(吡喃环骨架)、762 cm^?1(α-构型指示)和516 cm^?1处吸收，证实吡喃糖环及α-与β-糖苷键共存。刚果红实验在非碱性条件下λ_max显著红移且在碱液中保持稳定，表明CCP1A具稳定螺旋构象。¹H NMR在δ_H~5.42 ppm(α-糖苷键异头氢)及<5.0 ppm(β-糖苷键异头氢)有信号，进一步佐证α-和β-糖苷键并存。TEM显示为树枝状、不规则分散的微米级聚集体，内部呈纤维状或明显卷曲链状形貌，与螺旋构象相符。

4.3 Hypoglycemic Activity Analysis

4.3.1 Body Weight Change Analysis

模型组体重持续下降，CCP1A各剂量组(尤其高剂量)从第7周起体重显著高于模型组(p < 0.05)，接近阳性药组，表明CCP1A缓解T2D小鼠体重减轻。

4.3.2 Water Intake Analysis

模型组多饮显著，中、高剂量CCP1A从第8周起饮水量显著低于模型组(p < 0.05)，接近正常组，表明其改善多饮症状。

4.3.3 Food Intake Analysis

模型组多食显著，高剂量CCP1A从第7起摄食量显著低于模型组(p < 0.01)，接近正常组，表明其改善多食症状。

4.3.4 Organ Coefficients

模型组肝系数显著升高(p < 0.001)，CCP1A各剂量组均显著降低肝系数(p < 0.05)，高剂量组心系数亦显著降低(p < 0.05)，提示其对糖尿病相关脏器病变有一定改善。

4.3.5 FBG and OGTT Analysis

模型组FBG持续高值，CCP1A各剂量组自第6周起FBG显著低于模型组(p < 0.05)，高剂量组第7周后接近正常组；OGTT显示模型组曲线下面积(area under the glucose curve, AUCG)显著升高，CCP1A各剂量组AUCG显著低于模型组(p < 0.05)，高剂量组最接近正常组，表明CCP1A剂量依赖性降低FBG并改善糖耐量。

4.3.6 Lipid Profile Analysis

模型组TG、TC、LDL-C升高，HDL-C降低；CCP1A各剂量组TG、TC、LDL-C降低且HDL-C升高，呈剂量依赖性，高剂量组部分参数接近阳性药组，表明其改善高脂血症。

4.3.7 Histopathological Findings

模型组胰岛结构破坏、细胞萎缩、间质炎性浸润；CCP1A干预后胰岛结构趋于完整、细胞形态恢复、炎症减轻，高剂量组最接近正常组，表明其减轻胰腺病理损伤。

4.3.8 Liver Injury Markers Analysis

模型组血清ALT、AST显著升高(p < 0.001)，CCP1A高剂量组ALT、AST显著低于模型组(p < 0.001)且与阳性药组无差异，表明其减轻糖尿病致肝细胞损伤。

4.3.9 Glycogen Content Analysis

模型组肝和肌糖原显著降低(p < 0.05或p < 0.01)，CCP1A各剂量组肝糖原(低剂量起p < 0.05)和肌糖原(中剂量起p < 0.01)显著升高，高剂量组极显著(p < 0.001)，表明其促进糖原合成。

4.3.10 Digestive Enzyme Activity Analysis

模型组小肠α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性显著升高(p < 0.001)，CCP1A各剂量组两酶活性均显著抑制(p < 0.01或p < 0.001)，呈剂量依赖性，高剂量组α-葡萄糖苷酶抑制强于阳性药组，表明其延缓碳水消化吸收。

4.3.11 Oxidative Stress Markers and Antioxidant Capacity Analysis

模型组T-SOD、GSH-Px、CAT、T-AOC降低，MDA和GSP升高(p < 0.001)；CCP1A各剂量组T-SOD、GSH-Px显著升高(p < 0.001)，MDA显著降低(p < 0.001)，中、高剂量组CAT、T-AOC显著升高(p < 0.001)，GSP显著降低(p < 0.001)，表明其增强抗氧化防御、减轻脂质过氧化及短期糖基化。

4.3.12 mRNA Expression Analysis

模型组肝GCK、GLUT2、PI3K、AKT、Nrf2 mRNA下调，PEPCK mRNA上调(p < 0.001或p < 0.05)。CCP1A高剂量组GCK、GLUT2、AKT、PI3K、Nrf2 mRNA显著上调(p < 0.001或p < 0.01)，PEPCK mRNA显著下调(p < 0.001)；低剂量组上调AKT(p < 0.05)，中剂量组即显著上调PI3K、AKT及Nrf2(p < 0.01或p < 0.001)并下调PEPCK(p < 0.01)。表明CCP1A剂量依赖性地调节肝糖代谢、胰岛素信号及抗氧化防御相关基因转录。

讨论与结论总结(DISCUSSION译述)

本研究经提取纯化获得较高纯度(89.41%)、结构较明确的肉桂多糖CCP1A(M_w=8.161 kDa，含丰富葡萄糖和半乳糖醛酸，具吡喃糖环、α/β-糖苷键及稳定螺旋构象)。与以往仅关注粗多糖体外活性不同，本研究首次从整体动物表型、器官病理至肝基因表达层面系统评价了CCP1A在T2D小鼠体内的作用——CCP1A显著降低FBG、改善糖耐量和血脂紊乱，缓解"三多一少"症状及胰腺病理损伤；其作用涉及抑制肠道α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶以减少葡萄糖来源，上调肝GCK和GLUT2促糖原合成、下调PEPCK抑糖异生，以及上调Nrf2、PI3K、AKT mRNA增强抗氧化能力、降低MDA和GSP。需注意上述PI3K/AKT及Nrf2相关发现仅基于mRNA表达和生化指标，缺乏蛋白表达、磷酸化(如p-AKT、p-PI3K)及通路功能验证，尚不足以确认信号通路完全激活；血糖改善与氧化应激缓解难以完全区分是直接作用还是继发于降糖效应。此外本研究未设阿卡波糖单药对照组，无法直接比较肠糖苷酶抑制强度。CCP1A的多靶点调节特征符合天然多糖综合优势，为将其开发为抗T2D功能性食品提供了科学依据。未来需进一步明确CCP1A体内药代特征、直接分子靶标及精细结构(如甲基化分析、2D NMR)，并开展长期安全性评价。

研究结论翻译(Conclusion Translation)：

CCP1A是一种从中草药兼食材肉桂树皮中分离纯化的酸性杂多糖，具中等分子量、吡喃糖环、α-和β-糖苷键共存及稳定螺旋构象。在高脂饮食/STZ诱导的T2D小鼠中，CCP1A剂量依赖性地降低空腹血糖、改善糖耐量与血脂异常、缓解多饮多食体重丢失及胰腺损伤；其降糖机制包括抑制肠道α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶、促进肝和肌糖原合成、上调肝GCK/GLUT2及下调PEPCK以调节糖代谢、以及上调Nrf2/PI3K/AKT mRNA增强抗氧化防御。CCP1A展现出作为天然降糖功能性食品基质的潜力，后续需深入解析其精细结构、体内代谢过程及信号通路激活的直接证据。