SRSF1(丝氨酸/精氨酸丰富剪接因子1)/Mcl-1(髓样细胞白血病-1)轴驱动凋亡逃逸并塑造免疫微环境以促进胃癌进展

《HUMAN MUTATION》：SRSF1/Mcl-1 Axis Drives Apoptosis Evasion and Shapes the Immune Microenvironment to Promote Gastric Cancer Progression

　　

胃癌(GC)是全球发病率与死亡率最高的恶性肿瘤之一。凋亡逃逸是驱动肿瘤进展的癌症标志之一。剪接因子SRSF1(丝氨酸/精氨酸丰富剪接因子1)与抗凋亡蛋白Mcl-1(髓样细胞白血病-1，包括其异构体Mcl-1L和Mcl-1S)在肿瘤发生中发挥重要作用，但SRSF1-Mcl-1轴在胃癌中的调控机制尚不清楚。研究人员通过整合多数据库分析(TIMER、UALCAN、KM-Plotter)、体外实验(qRT-PCR、Western blot、Transwell迁移/侵袭、凋亡检测)、体内异种移植模型以及生物信息学方法(单细胞RNA测序、hdWGCNA、细胞互作分析、突变分析)系统评估了SRSF1在胃癌中的功能。结果显示SRSF1在胃癌组织与细胞系中显著过表达，并与患者不良预后相关。通过全面的多组学分析，研究人员首次揭示SRSF1阳性恶性上皮细胞具有独特的共表达网络，并与成纤维细胞互作显著增强，重塑肿瘤微环境(TME)。功能实验表明，SRSF1过表达通过抑制促凋亡异构体Mcl-1S并抑制线粒体凋亡通路(Bak/caspase-9/caspase-3)来增强细胞侵袭、迁移与凋亡抵抗。综上，SRSF1-Mcl-1轴是胃癌侵袭/迁移与凋亡逃逸的双重关键调控因子，为晚期胃癌靶向治疗提供了新策略。

研究背景方面，胃癌在全球范围内仍是发病率与死亡率居高的恶性肿瘤，许多地区确诊时已属晚期，长期生存率低，亟需阐明发病机制并开发有效诊疗策略。凋亡逃逸是驱动肿瘤侵袭与转移播散的核心机制之一。Bcl-2蛋白家族是线粒体凋亡通路的关键调控因子，其中Mcl-1(髓样细胞白血病-1)作为强效抗凋亡蛋白在多种人类癌症中过表达，与肿瘤进展、治疗耐药和不良预后密切相关；Mcl-1可产生两种功能异构体：抗凋亡的Mcl-1L与促凋亡的Mcl-1S，其比例失衡是凋亡逃逸的核心机制之一。Mcl-1异构体表达受剪接因子的严密调控，SRSF1(丝氨酸/精氨酸丰富剪接因子1)作为关键RNA结合蛋白可识别pre-mRNA上的特定顺式元件以决定外显子跳读或保留，从而控制靶基因的异构体转换，并在多种癌症中被证实可促进肿瘤倾向异构体产生从而增强增殖、转移与凋亡抵抗，但SRSF1是否通过调控Mcl-1异构体转换驱动胃癌凋亡逃逸此前尚不明晰。该研究即围绕SRSF1-Mcl-1轴在胃癌中的分子机制、对肿瘤微环境的影响及潜在治疗价值展开系统探究，论文发表于《Human Mutation》(人类突变)。

主要关键技术方法包括：利用TIMER、UALCAN、KM-Plotter等公共数据库进行差异表达与生存分析；采用TCGA-STAD队列的MAF文件进行突变分析(maftools)；使用GEO数据集GSE167297的9例胃活检样本(5例正常、4例肿瘤)UMI矩阵开展单细胞RNA测序分析(Seurat、inferCNV区分恶性上皮细胞)，并对恶性上皮细胞按SRSF1表达分为阳性与阴性组进行hdWGCNA(高维加权基因共表达网络分析，hdWGCNA包)以识别模块与功能富集；利用CellChat进行细胞–细胞互作分析；体外实验使用人胃上皮细胞GES-1与胃癌细胞系(AGS、HGC27、MKN28、MKN45、SNU-1)，通过慢病毒介导SRSF1过表达与shRNA敲低，结合qRT-PCR、Western blot、克隆形成、CCK-8、Transwell/Martrigel侵袭迁移、流式Annexin V-APC/7-AAD凋亡与PI细胞周期检测；体内建立BALB/c裸鼠异种移植模型评估肿瘤生长，并做IHC检测凋亡相关蛋白；统计采用SPSS与GraphPad Prism，多组比较用单因素ANOVA与LSD-t或非参数检验。

研究结果如下：

3.1. Multidatabase and Experimental Validation Reveal High Expression of SRSF1 Correlates With Poor Prognosis in GC：研究人员通过TIMER、UALCAN、KM-Plotter数据库分析发现SRSF1在包括胃腺癌在内的多种实体瘤中显著上调；胃癌队列中SRSF1在高龄(>65岁)、女性患者中表达更高；高SRSF1表达与患者较低的总生存率相关(HR=1.28，p=0.032)；实验验证五种胃癌细胞系(AGS、HGC27、MKN28、MKN45、SNU-1)中SRSF1 mRNA与蛋白均高于正常胃黏膜细胞(GES-1)，表明SRSF1过表达与胃癌不良预后相关。

3.2. Characterization of SRSF1-Positive Malignant Epithelial Cells：研究人员对胃癌样本12785个单细胞进行t-SNE分群得到10个主要细胞亚群；从中分离545个恶性上皮细胞并按SRSF1表达分层。hdWGCNA识别出6个基因模块，其中模块4(M4)与SRSF1阳性表型最强相关，GO富集显示各模块具独特生物学功能；SRSF1阳性与阴性细胞间特定模块枢纽特征值(hME)有显著差异，说明SRSF1阳性恶性上皮细胞具有独特转录共表达网络。

3.3. Interaction Landscape Analysis Between SRSF1+ Malignant Epithelial Cells and Other Cellular Subpopulations in Normal and Cancer Tissues：研究人员通过CellChat分析发现肿瘤样本细胞互作数量和强度均显著高于正常；热图显示SRSF1阳性恶性上皮细胞与成纤维细胞的互作尤其频繁且强；以SRSF1阳性细胞为信号源时，向成纤维细胞等受体的配体–受体信号在肿瘤中增强；关键促肿瘤信号通路如TGF-β与VEGF在SRSF1阳性恶性上皮细胞与成纤维细胞互作中显著激活，说明SRSF1阳性细胞重塑肿瘤微环境互作景观。

3.4. Mutational Analysis Between SRSF1-Low and High Tumor Samples：研究人员将TCGA-STAD分为SRSF1低表达(下四分位)与高表达(上四分位)各102例；突变谱显示两组最常见突变基因为TTN、TP53、MUC16等，但SRSF1高组APBA2突变富集(OR=12.099，p<0.01)，低组ZNF98、NBN突变更富集；ARID1A与TP53在低组呈显著互斥；表明SRSF1表达水平划分出具不同突变谱与肿瘤间异质性的胃癌亚型。

3.5. SRSF1 Overexpression Promotes Invasion, Migration, and Apoptosis Resistance in GC Cells In Vitro：研究人员在MKN28细胞中实现SRSF1敲低与过表达并验证效率；克隆形成实验显示过表达使克隆率从3.07%升至4.53%(p=0.003)；Transwell与Matrigel实验表明过表达增强迁移与侵袭，敲低减弱；流式Annexin V/PI检测显示过表达显著降低总凋亡、早期与晚期凋亡率；细胞周期分析显示过表达增加G₀/G₁期比例、减少S期比例，敲低相反但G₀/G₁变化不显著；CCK-8显示敲低抑制活力(24 h p<0.001，48 h p<0.05)，过表达增强24 h活力(p<0.001)但48 h与72 h无显著差异，说明SRSF1主要促迁移侵袭与凋亡抵抗，增殖效应短暂。

3.6. SRSF1 Modulates Apoptotic Protein Expression via Mcl-1 Regulation：研究人员先确认胃癌细胞系中Mcl-1总mRNA及Mcl-1L、Mcl-1S异构体mRNA和蛋白均高于GES-1；在MKN28中调制SRSF1后，qRT-PCR显示SRSF1改变对总Mcl-1 mRNA无显著影响(过表达略降不显著，敲低略升显著p<0.05)；Western blot显示SRSF1过表达显著抑制Mcl-1S蛋白(p<0.01)，敲低显著增加Mcl-1S(p<0.01)，而对Mcl-1L蛋白调控趋势相似但无统计显著性；下游线粒体凋亡标志物：SRSF1过表达显著降低BAK1、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白(p<0.01)，敲低则升高；qRT-PCR显示SRSF1过表达下调CASP3、CASP9、BAK1 mRNA(p<0.05)，敲低下调相反；TIMER数据Spearman分析显示SRSF1表达与静息肥大细胞、单核细胞、活化NK细胞、Treg负相关，与静息NK细胞、活化记忆CD4⁺T细胞、滤泡辅助T(Tfh)细胞、γδ T细胞正相关；说明SRSF1主要通过抑制Mcl-1S蛋白、抑制线粒体凋亡通路发挥抗凋亡作用，并与特定免疫细胞浸润模式相关。

3.7. Evaluating Impact of SRSF1 on Tumor Growth and Apoptosis-Related Proteins in Animal Models：研究人员建立裸鼠异种移植模型，SRSF1过表达组肿瘤重量较对照增约1.6倍(p<0.001)，敲低组降至对照60%(p<0.001)；体积过表达增约1.5倍(p<0.001)，敲低降至31%(p<0.001)；体重组间无差异；IHC定量显示过表达组肿瘤中Bak、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表达较对照显著降低(p<0.001)，敲低组显著升高(p<0.001)；证实SRSF1在体内通过抑制凋亡促进成瘤。

讨论部分总结：研究人员指出胃癌发病机制复杂，生物信息学确认SRSF1在多癌包括胃癌中上调且具有促癌作用，与年龄>65岁和性别相关但与TNM分期无关联；体外体内实验表明SRSF1过表达显著增强迁移、侵袭与抗凋亡，但对细胞活力与细胞周期的促进作用有限且短暂，提示SRSF1主要通过转移相关过程而非增殖驱动进展；SRSF1调控Mcl-1剪接，选择性抑制促凋亡Mcl-1S异构体(对其调控比对Mcl-1L更显著)，使Mcl-1L相对占优，进而抑制Bak寡聚化、阻止线粒体外膜透化、抑制caspase-9/caspase-3级联，实现凋亡逃逸；单细胞层面SRSF1阳性恶性上皮细胞有独特共表达模块(如M4富集凋亡抑制与免疫调节通路)，与成纤维细胞互作增强(TGF-β、VEGF通路)，可能在肿瘤微环境中间接驱动侵袭并塑造免疫抑制(与Treg降低、特定T细胞子集变化、NK细胞活性抑制等相关)；基因组层面高SRSF1肿瘤富集APBA2等突变，可能与剪接功能形成正反馈影响DNA修复与异质性；SRSF1作为剪接因子调控数百基因，对细胞周期的影响可能是多靶点多通路综合结果(如同时影响DNA复制相关基因剪接使S期减少、G₀/G₁增加)，并与“增殖–迁移权衡”中迁移优先表型一致(G₀/G₁样静止利于骨架重塑迁移)；研究局限性包未直接用RIP/CLIP证明SRSF1与Mcl-1 pre-mRNA特定元件结合，免疫微环境主要依赖数据库估计需原代共培养验证；总体SRSF1通过多维机制(免疫抑制、代谢重编程、凋亡调控)促癌，体内成瘤效应可能更多依赖肿瘤微环境中心机制(如CAF互作、免疫逃逸、代谢与血管生成)而非单纯细胞周期加速；翻译研究层面虽直接SRSF1小分子抑制剂少，但上游SRPK1(磷酸化激活SRSF1)可靶向，Mcl-1抑制剂(如S63845)在血液瘤临床试验中，用于胃癌需局部递送或联合免疫治疗拓宽窗口；结论部分翻译为：该研究系统阐明SRSF1在胃癌中的促瘤机制：SRSF1调控Mcl-1剪接以抑制促凋亡Mcl-1S异构体，从而抑制线粒体凋亡通路(即Bak/caspase-9/caspase-3轴)并增强胃癌细胞抗凋亡能力；SRSF1对胃癌细胞仅有短暂有限的促增殖效应，其核心作用是显著促进肿瘤迁移与侵袭，这归因于SRSF1介导的“运动–增殖优先级”策略，细胞资源优先分配给侵袭相关通路(如EMT关联基因的可变剪接)而非持续增殖；此外SRSF1通过重塑免疫抑制微环境(上调Treg、MDSC，抑制CD8⁺T细胞功能)与驱动代谢重编程(增强糖酵解、升高VEGF)构建多维促瘤网络，提示其作为胃癌治疗靶点需整合免疫调节与代谢干预策略；总之，对SRSF1机制的深入刻画为疾病诊断、预后评估和靶向治疗开发提供了新理论基础与可行策略。