癌症相关成纤维细胞中的CircSPECC1促进肺腺癌细胞侵袭与迁移并通过增强CCL2 mRNA稳定性发挥作用

《Journal of Radiation Research and Applied Sciences》：CircSPECC1 in cancer-associated fibroblasts promotes invasion and migration of lung adenocarcinoma cells and enhances CCL2 mRNA stability

　　

目的：环状RNA(circular RNA, circRNA)参与癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)介导的多种恶性肿瘤发生发展，但其在肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)中的作用及分子机制尚不清楚。方法：研究人员对LUAD患者来源的CAFs和正常成纤维细胞(normal fibroblasts, NFs)进行RNA测序以筛选差异表达circRNA；采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)在CAFs及LUAD患者血浆中验证候选circRNA表达，并以Kaplan-Meier法行生存分析评估预后价值；构建circSPECC1敲低及过表达载体，通过体外共培养体系及功能实验评估其对LUAD细胞生长及转移潜能的影响；运用RNA pull-down、RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation, RIP)、质谱及qRT-PCR探究其下游机制。结果：CAFs与NFs间筛选出若干差异表达circRNA，其中6个核心circRNA经qRT-PCR验证，circSPECC1在CAFs及LUAD患者血浆中显著差异表达，且与晚期病理分期及不良预后相关。circSPECC1是由SPECC1基因第4外显子反向剪接形成的胞质定位circRNA。CAFs中过表达circSPECC1促进LUAD细胞迁移和侵袭但不影响增殖。机制上，circSPECC1结合异质核糖核蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K, hnRNPK)，增强趋化因子(C-C基序)配体2(chemokine (C-C motif) ligand 2, CCL2) mRNA稳定性。结论：circSPECC1是LUAD潜在的预后指标，可通过与hnRNPK相互作用并调控CCL2 mRNA稳定性，介导CAFs诱导的LUAD细胞迁移侵袭，为LUAD中CAF靶向治疗提供了新思路。

本文对发表于《Journal of Radiation Research and Applied Sciences》的研究论文《癌症相关成纤维细胞中的CircSPECC1促进肺腺癌细胞侵袭与迁移并通过增强CCL2 mRNA稳定性发挥作用》进行解读总结。

研究背景与意义

肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中最主要的组织学亚型，尽管靶向及免疫治疗有所进展，患者长期生存率仍低于20%，肿瘤的高侵袭转移性是不良预后的主因。肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)通过分泌细胞因子促进LUAD细胞迁移、侵袭及治疗抵抗，是潜在治疗靶点。环状RNA(circular RNA, circRNA)是一类共价闭合、无蛋白编码能力的RNA分子，具有核酸酶抗性且在体液活检中稳定，可作为诊断预后标志物；已有少数报道提示CAF源性circRNA可调控肺癌进展，但circRNA在CAFs中介导LUAD进展的具体机制仍待阐明。本研究旨在从LUAD患者来源CAFs中筛选差异表达circRNA，明确circSPECC1的功能及其分子机制，为LUAD的CAF靶向治疗提供理论依据。

主要关键技术方法

研究人员收集江苏省肿瘤医院10例LUAD患者手术切除的肿瘤及距瘤体≥5 cm癌旁正常组织、30例LUAD患者及健康人血浆标本（经医院伦理委员会批准及受试者知情同意）。原代CAFs与正常成纤维细胞(normal fibroblasts, NFs)由组织块法分离培养并经α-SMA（α-平滑肌肌动蛋白）、波形蛋白(vimentin)、细胞角蛋白(cytokeratin)免疫组化鉴定。采用circRNA与mRNA芯片测序筛选差异表达circRNA，qRT-PCR验证候选circRNA在CAFs、NFs及血浆中的表达并行Kaplan-Meier生存分析。构建circSPECC1过表达及siRNA敲低载体转染CAFs；建立CAFs与LUAD细胞(A549、SPC-A1)Transwell共培养体系，行实时细胞分析(real-time cellular analysis, RTCA)迁移、Matrigel侵袭、划痕愈合及克隆形成实验；通过RNase R消化、发散/收敛引物PCR、核质分离及荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)鉴定circSPECC1特性与定位；采用RNA pull-down联合质谱、RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation, RIP)检测circSPECC1结合蛋白；放线菌素D(Actinomycin D) chase实验检测CCL2 mRNA半衰期；Luminex悬浮芯片及酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测细胞因子分泌，统计分析采用Wilcoxon符号秩检验、log-rank检验、t检验及单因素方差分析。

研究结果

3.1. Screening of differentially expressed circRNAs in CAFs（CAFs中差异表达circRNA的筛选）

研究人员从LUAD患者配对肿瘤及癌旁组织分离并鉴定原代CAFs（α-SMA⁺vimentin^highcytokeratin^-）和NFs（α-SMA^-vimentin⁺cytokeratin^-），行circRNA与mRNA测序。热图显示多数差异circRNA在CAFs中上调；差异mRNA的GO与KEGG富集提示CAFs高表达生长因子、趋化因子等可溶性信号分子。选取测序差异最显著的6个circRNA（circSPECC1、circANKRD17、circCORO1C、circRHOBTB3、circHIPK3、circHAS2）行qRT-PCR验证，结果与测序一致，证实CAFs与NFs间circRNA表达谱存在特征性差异。

3.2. CircSPECC1 was highly expressed in LUAD patients and may be a key biomarker for the progression of LUAD（circSPECC1在LUAD患者中高表达且可能是LUAD进展的关键生物标志物）

研究人员检测30例LUAD患者与健康对照血浆中6个候选circRNA，circSPECC1在LUAD患者血浆中显著下调（与CAFs中上调趋势对应，反映组织-血浆释放特征），其余circRNA也呈现与组织一致的变化方向。进一步分析发现circSPECC1表达水平在N1–N2期患者肿瘤组织中低于N0期（P＜0.05），且高表达circSPECC1的患者总生存期更短，提示其与LUAD进展和不良预后密切相关，有望作为LUAD进展的候选生物标志物。

3.3. Characterization of circSPECC1 in CAFs（CAFs中circSPECC1的特征鉴定）

circSPECC1由17号染色体SPECC1基因第4外显子反向剪接(back-splicing)形成。其在CAFs中表达显著高于NFs及LUAD细胞系(A549、SPC-A1)。RNase R处理后circSPECC1不被降解而线性SPECC1 mRNA被降解；发散引物可从cDNA而非基因组DNA(genomic DNA, gDNA)扩增circSPECC1，收敛引物可扩增线性SPECC1，证实其为环状结构。circSPECC1与宿主基因SPECC1 mRNA表达无相关性，敲低或过表达circSPECC1不影响SPECC1转录本水平。核质分离及FISH显示circSPECC1主要定位于CAFs细胞质中。

3.4. High expression of circSPECC1 in CAFs promotes LUAD cell invasion and migration in vitro（CAFs中高表达circSPECC1促进LUAD细胞体外侵袭与迁移）

研究人员建立CAFs与A549细胞共培养体系，RTCA、Matrigel Transwell及划痕实验显示CAFs过表达circSPECC1(CAFs-TC)显著促进A549细胞迁移与侵袭；克隆形成实验表明不影响A549细胞增殖。直接在A549细胞中过表达circSPECC1不能促进其侵袭，说明促转移作用依赖于CAFs中的circSPECC1而非肿瘤细胞自身表达。

3.5. CircSPECC1 interacts with RNA binding protein hnRNPK in CAFs（circSPECC1在CAFs中与RNA结合蛋白hnRNPK相互作用）

鉴于circSPECC1定位于胞质，研究人员行RNA pull-down（circSPECC1连接区生物素探针）联合质谱及Western blot，鉴定异质核糖核蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K, hnRNPK)为其结合蛋白，RIP-qPCR进一步验证hnRNPK可富集circSPECC1。CAFs中过表达circSPECC1不改变hnRNPK的mRNA及蛋白水平，表明circSPECC1与hnRNPK形成RNA-蛋白复合物但不调控hnRNPK表达。

3.6. CircSPECC1 binds to hnRNPK to enhance the stability of CCL2 mRNA（circSPECC1结合hnRNPK增强CCL2 mRNA稳定性）

Luminex芯片筛查发现circSPECC1敲低后CAFs条件培养基中VEGFA、CCL2、IL-7蛋白及对应mRNA下调；30例LUAD患者血浆中仅CCL2蛋白水平与circSPECC1呈显著正相关(R²=0.49, P＜0.05)。放线菌素D chase实验显示敲低circSPECC1显著缩短CCL2 mRNA半衰期；生物信息学预测CCL2 mRNA的3′-非翻译区(3′-untranslated region, 3′-UTR)含hnRNPK潜在结合位点。综上，CCL2是circSPECC1/hnRNPK轴的关键下游效应分子。

讨论与结论总结

既往circRNA在LUAD中的研究多聚焦于肿瘤细胞本身，本研究首次揭示CAF源性circSPECC1通过结合hnRNPK增强CCL2 mRNA稳定性，促进LUAD细胞迁移侵袭而不影响增殖，且circSPECC1在CAFs中的作用不同于其在LUAD细胞内的ceRNA机制。研究局限性包括缺乏体内动物实验、未通过挽救实验验证hnRNPK在CCL2稳定化中的因果作用、未明确CAFs中circSPECC1上调的上游机制及血浆circSPECC1的诊断效能等，有待后续扩大样本验证。

结论翻译：研究人员发现，肺腺癌(LUAD)癌相关成纤维细胞(CAFs)中circSPECC1表达升高与患者生存率降低密切相关。circSPECC1是一种由SPECC1基因第4外显子反向剪接形成的胞质定位环状RNA(circRNA)，在CAFs中高表达时可结合异质核糖核蛋白K(hnRNPK)，于转录后水平增强趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2) mRNA稳定性，促进LUAD细胞侵袭与迁移。本研究揭示了CAFs调控LUAD进展的新机制——CAF源性circSPECC1–hnRNPK–CCL2轴，并提示circSPECC1可作为LUAD潜在的预后指标及CAF靶向治疗的候选分子。