睾酮增强人胶质母细胞瘤细胞的克隆形成能力和自我更新能力

《The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology》：Testosterone increases clonogenicity and self-renewal capacity of human glioblastoma cells

　　

胶质母细胞瘤是成人中最常见且侵袭性最强的恶性脑肿瘤，具有快速进展和治疗反应有限的特点。胶质瘤干细胞的存在导致肿瘤高复发率及治疗抵抗。流行病学数据显示男性胶质母细胞瘤发病率高于女性，提示性激素可能在疾病进展中发挥作用。为评估睾酮对胶质母细胞瘤干性相关特征的影响，研究人员对男性来源的人胶质母细胞瘤细胞系进行了雄激素受体（androgen receptor, AR）调控及睾酮暴露响应的分析。通过定量AR蛋白水平并进行功能实验以评估克隆形成能力、神经球形成及干性相关基因表达。T98G和U251人胶质母细胞瘤细胞系均表达AR。值得注意的是，神经球中AR表达高于单层培养细胞，且睾酮可进一步上调其表达。在悬浮培养中，睾酮显著增强克隆形成潜能，表现为原代和次级神经球数量和体积的增加。睾酮上调干性相关基因（PROM1、SOX2和NES）的表达，并在分化实验中提高Sox2阳性细胞数量。总体而言，这些发现表明睾酮增强人胶质母细胞瘤细胞的克隆形成能力和自我更新能力，凸显雄激素信号作为肿瘤适应性的关键调控因子以及靶向破坏胶质母细胞瘤干细胞样细胞维持的治疗靶点的潜力。

该研究发表于《The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology》，聚焦于雄激素信号在胶质母细胞瘤干性维持中的调控作用及其治疗意义。

**研究背景与问题**

胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）是成人最常见且致死率最高的原发性脑肿瘤，确诊后中位生存期仅14–16个月，五年生存率不足5%。该肿瘤属于世界卫生组织（World Health Organization, WHO）分级4级的星形细胞来源肿瘤，以弥漫性边界和广泛脑组织浸润为特征。标准治疗方案包括最大范围手术切除联合放疗及烷化剂替莫唑胺化疗。值得注意的是，胶质母细胞瘤存在显著的性别差异，男性发病率约为女性的1.5倍，这种性二态性现象强烈提示性激素参与肿瘤的发生发展。

雄激素（androgens）是调控男性性征发育与维持的类固醇激素，睾酮（testosterone, T）是外周循环中的主要雄激素。睾酮通过与雄激素受体（androgen receptor, AR）结合诱导其构象改变，促进受体激活并转位至核内，作为配体激活的转录因子发挥功能。AR信号除生理作用外，还参与调控细胞增殖与存活相关的关键通路如AKT/mTOR和MAPK通路，并在多种肿瘤的发生发展中扮演重要角色，特别是在前列腺癌中的研究最为深入。

近年研究表明，AR信号失调与胶质母细胞瘤的维持和进展密切相关。AR在胶质母细胞瘤组织中mRNA和蛋白水平均显著过表达，且与正常脑组织及低级别胶质瘤相比具有明显差异。AR蛋白在肿瘤增强区及瘤周区域的表达高于肿瘤核心。然而，AR水平在男女患者间无显著差异，提示男性高发病率并非单纯由AR表达量解释。临床数据显示，胶质母细胞瘤患者血清睾酮水平普遍高于非癌症对照人群或良性脑肿瘤患者；脑脊液中睾酮水平在男女患者中均升高，且男性肿瘤内睾酮水平高于女性。这种升高与肿瘤侵袭性增加及预后不良相关。此外，胶质母细胞瘤细胞表达局部雄激素合成所需酶类，提示 systemic 及肿瘤源性睾酮均可能影响肿瘤进展。

胶质母细胞瘤中存在具有干细胞样特征的细胞亚群，称为胶质瘤干细胞（glioma stem cells, GSCs），其与神经干细胞/祖细胞具有共同特征，甚至被提出可能为肿瘤起源细胞。GSCs具有高增殖和自我更新能力，并能分化为多种神经胶质谱系。近期研究揭示AR表达与胶质母细胞瘤干性之间存在强关联：AR拮抗剂可减少GSC增殖、诱导凋亡并降低CD133⁺癌症干细胞数量，下调c-Myc、SOX2和OCT4等干性标志物，并减弱神经球形成能力，提示自我更新受损。5α-还原酶抑制剂非那雄胺（finasteride）通过减少睾酮向二氢睾酮（dihydrotestosterone, DHT）的转化，可降低胶质母细胞瘤中干细胞样细胞神经球形成及Sox2表达。然而，尽管AR与干性存在关联，尚缺乏睾酮直接影响胶质母细胞瘤干细胞样细胞维持的直接证据。基于此，该研究旨在阐明睾酮在调控胶质母细胞瘤细胞干性相关特征中的作用。

**主要技术方法**

研究人员采用男性来源的人胶质母细胞瘤细胞系U251和T98G作为研究对象，运用生物信息学分析结合体外实验验证的策略开展工作。生物信息学方面，利用GEPIA2网络平台整合The Cancer Genome Atlas（TCGA）和The Genotype-Tissue Expression（GTEx）数据库数据，分析AR在胶质母细胞瘤及低级别胶质瘤中的表达特征；通过JASPAR数据库获取AR序列识别矩阵，采用FIMO软件对PROM1、SOX2和NES基因启动子区域进行潜在雄激素反应元件（androgen response elements, AREs）分析，设定p值阈值<0.001。体外实验方面，建立悬浮培养神经球模型以富集干细胞样细胞，采用Western blot检测AR蛋白表达，RT-qPCR定量干性相关基因mRNA水平，台盼蓝排除法进行细胞计数和活力检测，免疫荧光检测Sox2蛋白定位及定量分析，并通过氯硝丁胺（flutamide）竞争性拮抗实验验证AR介导效应。

**研究结果**

**生物信息学揭示AR在人胶质瘤中的表达特征**：通过GEPIA2平台对TCGA和GTEx数据库的in silico分析证实，AR转录本水平在胶质母细胞瘤及低级别胶质瘤中均显著上调，星形细胞瘤中AR表达高于健康样本，而少突胶质细胞瘤与健康组织相比无显著差异。在分子亚型层面，经典型、间叶型和前神经型胶质母细胞瘤的AR水平均显著高于正常组织，表明AR表达与胶质瘤特别是星形细胞来源肿瘤的存在正相关。

**睾酮调控人胶质母细胞瘤细胞AR表达**：Western blot分析显示，100 nM睾酮处理显著上调U251和T98G细胞中AR蛋白表达；AR拮抗剂flutamide单独处理无显著效应，但在T98G细胞中可部分阻断睾酮的诱导效应。这证明睾酮正向调控人胶质母细胞瘤细胞中AR表达。

**次级神经球培养模型的建立及AR表达特征**：成功建立原代-次级神经球培养体系，T98G细胞形成致密、边界清晰的球体，而U251神经球呈更弥散、边界不规则的形态。免疫荧光证实两种细胞系次级神经球均表达干细胞标志物Sox2。RT-qPCR显示次级神经球中AR转录本水平显著高于对应单层培养细胞，提示AR信号可能与神经球维持相关。

**睾酮增强胶质母细胞瘤神经球克隆形成潜能**：在贴壁条件下，睾酮显著增加T98G和U251细胞总数但不影响细胞活力。以100 nM睾酮预处理48小时后进行原代神经球形成实验，结果显示睾酮显著促进神经球形成，表现为神经球形成效率（neurospheres formation efficiency, NFE）显著提高及神经球直径显著增大，且该效应不受细胞活力变化干扰。这表明睾酮有利于原代神经球生成并增强其克隆形成潜能。

**AR介导睾酮诱导的次级神经球形成效应**：为验证次级神经球形成是否需要AR激活，研究人员设置睾酮、flutamide及联合处理组。结果显示睾酮显著增加次级神经球数量和直径，该效应被flutamide完全阻断；flutamide单独处理亦可降低神经球数量和大小。这表明睾酮对胶质母细胞瘤自我更新的促进作用依赖于AR信号，且基础AR活性对于干细胞样群体的维持具有必要性。

**睾酮促进干性标志物表达及Sox2⁺胶质瘤干细胞样细胞维持**：生物信息学分析发现PROM1、SOX2和NES基因启动子区域存在潜在AREs。RT-qPCR证实睾酮处理显著上调次级神经球中上述三者为干性标志物的mRNA水平。在分化实验中，去除生长因子并添加10%胎牛血清诱导分化2周后，免疫荧光显示睾酮处理组保留更多Sox2阳性细胞，表明睾酮在促进分化的条件下仍能维持细胞的未分化、干性状态。

**讨论与结论**

研究人员系统阐述了睾酮通过AR信号增强人胶质母细胞瘤干细胞样细胞克隆形成和自我更新能力的分子机制。该研究首先以生物信息学分析为基础，确认AR在胶质母细胞瘤及多种分子亚型中的广泛上调，为其作为临床治疗靶点提供理论依据。核心发现包括：AR在干细胞富集的神经球中高表达且受睾酮正反馈调控；睾酮以AR依赖方式增强原代和次级神经球形成能力；该效应与干性标志物PROM1、SOX2和NES的上调及分化条件下Sox2⁺细胞的持续存在相关。

该研究的临床意义在于，首次直接证明睾酮而非仅AR拮抗剂效应可促进胶质母细胞瘤干性维持，为理解男性胶质母细胞瘤高发病率提供了机制性解释。结合临床观察到的患者血清及脑脊液睾酮升高现象，提示抗雄激素治疗或靶向AR信号可能通过削弱肿瘤干细胞库改善患者预后。与先前报道的enzalutamide或finasteride降低克隆形成能力的结果相呼应，该研究进一步确认AR信号在干性维持中的核心地位。

局限性在于所用细胞系均来源于男性患者，无法确定睾酮在女性来源胶质母细胞瘤中是否通过相似通路发挥作用，未来需纳入LN229等女性来源模型进行验证。尽管如此，该研究为探索雄激素信号贡献于胶质母细胞瘤进展的框架提供了重要基础。

研究结论：总体而言，该研究发现睾酮促进人胶质母细胞瘤的克隆形成和自我更新，凸显雄激素信号作为调控该肿瘤干性的潜在治疗靶点，为开发靶向破坏胶质母细胞瘤干细胞样细胞维持的新型治疗策略提供了实验依据。