裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)PUFA合酶ER结构域形成稳定异二聚体

《Journal of Structural Biology: X》：Thraustochytrid PUFA synthase ER domains form a stable heterodimer

　　

Ω-3多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）是人体必需营养素，由被称为PUFA合酶（PUFA synthase，Pfas）的专化酶从头合成。这些酶的各结构域在结构上与哺乳动物或细菌脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FAS）及微生物聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）的相应结构域相关。裂殖壶菌（thraustochytrids）和黏细菌（myxobacteria）中的Pfas通常由三条多肽链组成，海洋γ-变形菌（gammaproteobacteria）中则由四条组成。烯酰-ACP还原酶（enoyl-ACP reductase，ER）结构域通过在修饰反应中催化碳?碳双键的还原，在PUFA合成中起关键作用。在γ-变形菌中，单独的ER结构域作为巨合酶内的独立蛋白PfaD存在；而在裂殖壶菌中，ER结构域同时存在于PfaB（ERb）和PfaC（ERc）中，其具体功能角色尚不清楚。既往研究表明ER结构域在Pfas、FAS和PKS系统中以同源二聚体形式发挥作用。本研究以裂殖壶菌Schizochytrium sp.的PUFA合酶为对象，通过多角度光散射尺寸排阻色谱（size-exclusion chromatography with multi-angle light scattering，SEC-MALS）及结合黄素单核苷酸（flavin mononucleotide，FMN）的2.2 ?分辨率晶体结构证实，ERb与ERc相互作用形成异二聚体。研究结果表明ER结构域可能促进PfaB与PfaC之间的二聚化。此外，分子对接和结构比对支持ERb与ERc活性涉及FMN和NADH的乒乓机制（ping-pong mechanism）。据研究人员所知，这是首个报道的裂殖壶菌PUFA合酶ER结构域复合物的晶体结构，为阐明此类酶的作用机制提供了新见解。

裂殖壶菌PUFA合酶ER结构域形成稳定异二聚体的结构与功能研究解读

研究背景与立题依据：

Ω-3多不饱和脂肪酸（PUFA），如二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA，22:6ω3）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA，20:5ω3），对人类健康至关重要。目前PUFA生产主要依赖鱼油，但因过度捕捞、气候变化及需求增长而不可持续，预计2050年将出现约100万吨缺口。海洋微生物如裂殖壶菌（thraustochytrids）和γ-变形菌可通过PUFA合酶（Pfas）厌氧途径从头合成PUFA，是可持续替代来源。裂殖壶菌Pfas通常由PfaA、PfaB、PfaC三条多肽链组成，分别含缩合（酮合酶[ketosynthase，KS]、丙二酰?CoA酰基转移酶[malonyl?CoA acyltransferase，MAT]）、修饰（酮还原酶[ketoreductase，KR]、脱水酶[dehydratase，DH]、烯酰?ACP还原酶[enoyl?ACP reductase，ER]）结构域及多个串联酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP）结构域。γ-变形菌Pfas含独立的PfaD（ER结构域，TIM?桶超家族），而裂殖壶菌PfaB含ERb、PfaC含ERc，二者序列与PfaD约50%相同，但其具体寡聚状态、相互作用方式及在完整Pfas复合物中的组装意义均未见报道。明确ERb与ERc的寡聚化模式及结构特征，对理解Pfas组装机制和理性改造高产DHA工程菌株具有重要意义。本研究发表于《Journal of Structural Biology: X》。

主要关键技术方法：

研究人员以裂殖壶菌Schizochytrium sp. ATCC 20888为样本来源，构建PfaB C端ERb（残基1538–2059）和PfaC C端ERc（残基982–1502）的原核表达载体；通过单独及共表达ERb（MBP融合标签）与ERc（His₆标签），利用亲和层析及尺寸排阻色谱（size?exclusion chromatography，SEC）纯化；采用SEC偶联多角度光散射（SEC?MALS）测定溶液态分子量以判定寡聚状态；利用Sypro Orange热位移实验测定蛋白热稳定性（melting temperature，T_m）；共表达ERb?ERc复合物经结晶后收集同步辐射X射线衍射数据，通过AlphaFold3预测模型进行分子置换求解2.2 ?分辨率晶体结构（PDB 9SDD），并使用Coot手动修模、Phenix精修；借助PISA与PLIP进行界面分析；通过AlphaFold3预测ERbc?ACP对接模型；采用SwissDock（AutoDock Vina）对接巴豆酰?CoA（crotonyl?CoA）及基于Shewanella oneidensis PfaD?NAD⁺及Streptococcus pneumoniae FabK?TUI复合物结构叠加分析辅因子与抑制剂结合模式；进行基于最大似然法与贝叶斯推断的系统发育分析。

研究结果：

2.1 真核与原核PUFA合酶ER结构域的系统发育比较

研究人员对选取的FAS FabK、PKS?ER、γ?变形菌PfaD及裂殖壶菌ERb/ERc进行系统发育分析，发现所有PUFA合酶ER结构域（PfaD、ERb、ERc）与PKS?ER亲缘关系近（约40%序列相同），但与FAS FabK较远（约20%相同）。裂殖壶菌ERb与ERc分别聚类，其中ERb较早分化，ERc可能由ERb复制衍生；定鞭藻Emiliania huxleyi的ER结构域聚于ERb分支，提示其源自ERb祖先。裂殖壶菌ERb与ERc相互约75%–80%相同，与细菌PfaD约50%相同，且保留PfaD特征性的约80氨基酸N端延伸及PKS?ER保守插入序列。单独表达可溶性scERb（MBP融合）发生聚集且不结合FMN；单独表达scERc可溶、呈黄色（结合FMN），SEC?MALS显示以同源二聚体（102.3 kDa）为主，少量单体（63.2 kDa）。共表达scERb?scERc获得可溶scERbc异源二聚体复合物并结合FMN，SEC?MALS测得其分子量约106 kDa，证实异二聚体形成；热位移实验显示scERc（T_m＝37.88±2.02℃）与scERbc（T_m＝39.21±1.18℃）稳定性相当，而单独scERb不稳定无法检测熔解曲线，表明ERb需与ERc结合才能正确折叠与结合FMN。

2.2 scERbc整体晶体结构

scERc单独结晶分辨率仅3.8 ?未入库；scERbc异二聚体晶体结构解析至2.2 ?（空间群I1₂1，PDB 9SDD）。每个ER结构域由三部分组成：N端亚结构域（scERb残基1538–1590，scERc残基985–1036，为PUFA合酶ER特有）、中央TIM?桶核心亚结构域（scERb残基1591–1862，scERc残基1037–1308，含8个α螺旋和7条β链，缺失典型TIM?桶的第8条β链但具PKS?ER/PfaD特征性额外反向平行β链及两侧α螺旋）、盖亚结构域（lid subdomain，scERb残基1863–2056含额外α螺旋，scERc残基1309–1502）。两结构域间RMSD为0.617 ?，高度保守。FMN非共价结合于两亚基TIM?桶裂隙中，电子密度清晰可见。

2.3 scERbc界面分析

PISA分析显示scERbc异二聚体界面面积2366.7 ?²，含27个氢键、11个盐桥、17个疏水相互作用及13个水桥，界面形成自由能增益ΔⁱG＝?11.1 kcal/mol，ΔⁱG p值为0.423（提示为非强专一性但具生物学相关性二聚体）。与AlphaFold3预测的scERc同源二聚体（界面2647.5 ?²，ΔⁱG＝?11.0 kcal/mol，p值0.506）及scERb同源二聚体模型（界面2226.8 ?²，ΔⁱG＝?13.8 kcal/mol，p值0.290）相比，scERbc界面极性接触丰富且含水介导相互作用，而已解析的细菌PfaD（soPfaD、spPfaD）及FabK（spFabK、tmFabK）虽界面面积相近或更小，但疏水相互作用更多、ΔⁱG更负（?26.1至?42.9 kcal/mol）、p值更低（0.002–0.047），表明裂殖壶菌ER二聚化模式在界面组成与能量学上区别于典型TIM?桶ER同源二聚体。

2.4 scERbc活性中心催化残基保守性及与相关酶比较

TIM?桶ER催化残基为保守组氨酸（scERb H1776，scERc H1222），对应FabK与PfaD中已报道催化His。三个特征基序为：基序I（APMxG，scERb为G¹⁶⁰⁶AMAKG，Met¹⁶⁰⁸与FMN互作，ER结构域在X与M间具独特插入）；基序II（[VI]SFHF[GN]x，scERb为VEASAFM，保守性差，FabK中为Gly替代Ser）；基序III（xEAGGH，scERb为ADSGGH，含催化His）。这些基序在裂殖壶菌ERb/ERc、细菌PfaD及PKS?ER中保守，与2?硝基丙烷单加氧酶（2?NMO）部分相似。

2.5 scERbc与辅因子的相互作用——2.5.1 FMN结合

FMN异咯嗪环与scERb的A1607、A1609（基序I）、N1659、S1688（基序II）、K1722、E1770形成氢键；核糖醇部分与G1606、E1770作用；磷酸基团与G1814、G1815、G1774、G1836、T1837形成氢键。催化H1776经由水分子与FMN形成水桥。保守M1608（基序I）及盖亚结构域W1985与FMN发生疏水堆积；I1816（TIM?桶）及盖亚结构域V1834、V1838、A1989参与水介导相互作用。FMN结合微环境与PfaD、FabK及PKS?ER高度保守。

2.6 NAD⁺结合预测

因无ERbc?NAD(P)H共晶结构，研究人员将scERbc与Shewanella oneidensis PfaD?NAD⁺（PDB 4Z9R）结构叠加以预测结合。NAD⁺占据与FMN相同通道，催化H1776及保守S1968可能与NAD⁺成氢键；W1985、F1934可与NAD⁺腺嘌呤发生π?堆积，结合时W1985可能发生构象变化以避免位阻。L1964、S1965通过水桥与NAD⁺作用。预测结合模式与其他TIM?桶ER一致。

2.7 scERbc与scACP及酰基基团相互作用——2.7.1 scACP对接

AlphaFold3预测Schizochytrium sp. PfaA首个ACP结构域（scACP，残基1116–1200）主要与scERc的盖亚及TIM?桶亚结构域互作，次要与scERb TIM?桶作用；scACP活性丝氨酸S1158朝向scERb催化H1776及scERc对应His（H1222）。ACP表面带强负电，scERc互作区表面带正电荷，scERb TIM?桶区弱正电，静电互补利于ACP锚定与底物靠近活性中心。

2.8 Crotonyl?CoA对接

将crotonyl?CoA对接至scERb催化中心H1776附近，预测其占据TIM?桶与盖亚亚结构域间口袋，介于scACP S1158与H1776之间；S1724可能与羰基氧形成氢键，H1776 Cβ与crotonyl?CoA Cβ/Cα距离符合范德华接触。Crotonyl?CoA α碳与NAD⁺存在空间重叠，提示底物与还原型辅因子不同时结合。

2.9 TUI抑制剂建模

将Streptococcus pneumoniae FabK?TUI复合物（PDB 2Z6J）叠加至scERbc，TUI结合位点与FMN、NAD⁺、crotonyl?CoA重叠，与A1689、E1770可能形成氢键，与M1691、催化His及W1985产生位阻，推测TUI对NAD(P)H为竞争性抑制，对crotonyl?CoA为反竞争性抑制，与FabK中报道一致，支持乒乓催化机制。

讨论与结论总结：

烯酰?ACP还原酶（ER）结构域催化ACP结合不饱和脂酰中间体最终还原步骤，依赖FMN与NAD(P)H按乒乓机制进行氢负离子转移。裂殖壶菌Pfas含两个TIM?桶ER结构域——PfaB中ERb与PfaC中ERc；系统发育分析显示二者聚于γ?变形菌PfaD旁，ERc为近期ERb重复产物，ERb较原始。生化实验表明单独scERb不溶且不结合FMN，scERc可溶并形成同源二聚体，共表达则形成稳定scERbc异二聚体（SEC?MALS验证），且scERb稳定性依赖与scERc结合。在完整Pfas中，PfaC内DH?DH形成分子内二聚体，故体内ERc无需同源二聚化，而倾向于与ERb形成异二聚体以促进PfaB?PfaC组装及ERb正确折叠与FMN结合。scERbc异二聚体与预测scERc同源二聚体界面富含极性/水介导作用、疏水作用较少、ΔⁱG较高，区别于PfaD/FabK典型同源二聚体界面。scERbc保留PUFA合酶ER特有N端亚结构域及保守基序I?III、FMN/NAD⁺/底物结合模式，对接与TUI抑制分析支持乒乓机制（FMN先被NAD(P)H还原，NAD(P)⁺解离后底物进入被还原，FMNH₂氧化回FMN）。先前基因敲除研究推论ERb/ERc功能分化缺乏生化依据，本研究证明ERb单独不稳定且无活性，提示需从结构折叠、辅因子结合及异二聚化角度重新诠释表型。

综上，研究人员首次解析了裂殖壶菌PUFA合酶ERb?ERc异二聚体2.2 ?晶体结构（PDB 9SDD），通过SEC?MALS、热位移及分子对接证实其形成稳定异二聚体并阐明FMN/NAD(P)H/底物结合与乒乓催化模型，为理解真核PUFA合酶组装机制及理性改造微生物PUFA高产菌株提供了结构生物学基础。