开发了一种多重实时PCR方法用于检测免疫抑制病毒，并在其初步应用于肉鸡养殖中进行了验证

《Journal of Virological Methods》：Development of a multiplex real-time PCR method for detecting immunosuppressive viruses and its preliminary application in broilers

　　

陈振宇|李玉福|黄一阳|尤里·齐亚普沙|胡双|张鹏|蔡文博|沈涛红

沈阳工业大学生命工程学院，中国抚顺113122

摘要

背景

马立克病病毒（MDV）、鸡贫血病毒（CAV）、禽腺病毒（FADV）、禽网状内皮组织炎病毒（REV）、禽呼肠孤病毒（ARV）和传染性法氏囊病病毒（IBDV）是影响肉鸡的常见免疫抑制性疾病，其发病率很高。为了解决这一问题，我们设计了一种多重实时定量PCR（qPCR）方法来检测这六种病毒。该方法设计了针对MDV Meq基因、CAV VP2基因、FADV五聚体基因、REV gp90基因、ARV S1基因和IBDV VP2基因的特异性引物和探针，并建立了一种基于TaqMan探针的一步RT-qPCR方法。该方法具有高效、稳定和灵敏的特点，对所有六种病毒的最小可检测质粒浓度为1拷贝/μL。此外，这六种病毒检测方法的变异系数均低于3%。该方法表现出强烈的线性关系（R2 ≥ 0.998），扩增效率在96%到104%之间。对94份患病鸡的临床肝脏样本进行检测后发现，CAV的阳性率最高，为91.49%。在阳性样本中，双重感染、三重感染、四重感染和五重感染的比例分别为30.00%、37.78%、13.33%和1.11%。研究表明，qPCR方法是一种检测肉鸡中六种免疫抑制性疾病病毒的新方法。这些病毒在辽宁省的鸡群中普遍存在共感染现象。

部分摘录

背景

随着家禽业的发展，鸡的免疫抑制病毒受到了越来越多的关注。常见的免疫抑制病毒包括马立克病病毒（MDV）、鸡贫血病毒（CAV）、禽腺病毒（FADV）、网状内皮组织炎病毒（REV）、禽呼肠孤病毒（ARV）和传染性法氏囊病病毒（IBDV）。这些病毒感染宿主后，会对肉鸡的免疫器官造成不同程度的损害，并能逃避宿主的先天免疫系统。

样本制备

用于治疗MDV（CVI988型）、CAV（CAV-VAC型）、ARV（1133型）和IBDV（D87型）的疫苗购自美国默克公司。新城疫病毒（NDV）疫苗（La Sota株）、禽流感病毒（AIV）疫苗（H9亚型）和鸡传染性支气管炎病毒（IBV）疫苗（M41株）购自中国哈寿伟科公司。FADV（CVCC AV1549）和REV（CVCC AV354）来自中国兽医细菌菌株保藏中心。

标准质粒的制备

MDV、CAV、FADV、REV、ARV和IBDV的标准质粒浓度分别为7.882 × 10¹⁰拷贝/μL、2.155 × 10¹⁰拷贝/μL、5.306 × 10¹⁰拷贝/μL、4.443 × 10¹⁰拷贝/μL、3.261 × 10¹⁰拷贝/μL和8.007 × 10¹⁰拷贝/μL。此外，测序结果证实了这些基因组的存在（图1）。

反应体系与优化

通过实验，我们确定了两种最佳反应体系，如表3所示，两种体系的最佳退火温度均为60°C。

讨论

家禽中的免疫抑制性疾病对家禽养殖业构成了重大威胁，尤其是在肉鸡生产领域造成了巨大的经济损失。尽管这些疾病很少导致急性死亡，但它们通常表现为与病毒和细菌感染相关的非典型症状，以及对特定疫苗的免疫反应减弱或消失，最终影响生产效率。导致家禽免疫抑制的常见病原体包括...

结论

本研究建立的方法具有重要的临床应用价值，可以通过两种反应体系使用相同的反应程序来检测鸡场中的MDV、CAV、FADV、REV和IBDV。此外，该方法证实了辽宁省存在鸡免疫抑制病毒的混合感染现象。最终，这种检测方法可以用于预防和控制鸡的免疫抑制疾病。

伦理批准和参与同意

沈阳艾友生物科技有限公司已书面同意提供用于研究的样本。

(陈等人，2019年；黄等人，2022年)

资助

本研究得到了中国辽宁省自然科学基金的支持，项目编号为2023JH2/101700133。

CRediT作者贡献声明

尤里·齐亚普沙：监督。黄一阳：验证。张鹏：撰写——初稿，概念构思。胡双：资金获取，概念构思。沈涛红：方法学。蔡文博：方法学。陈振宇：方法学。李玉福：软件，方法学。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

感谢沈阳艾友生物科技有限公司提供用于本研究的肉鸡临床样本。

出版同意

不适用。

作者声明没有利益冲突。