综述：开发了一种实时PCR检测方法，用于追踪虾类养殖生态系统水中噬蓝菌及其宿主聚球藻的时空动态

《Journal of Virological Methods》：Development of a real-time PCR assay for tracking the spatiotemporal dynamics of a cyanophage and its Synechococcus host in waters of shrimp aquaculture ecosystems

　　塔尼娅·恩里克斯-埃斯皮诺萨（Tania Enríquez-Espinoza）| 费尔南多·门多萨-卡诺（Fernando Mendoza-Cano）| 特里尼达·恩西纳斯-加西亚（Trinidad Encinas-García）| 帕特里夏·奥尔金-莱昂（Patricia Olguín-León）| 女梅娜·达马斯·卢纳（Jimena Damas Luna）| 阿德里亚娜·穆利亚-阿尔马桑（Adriana Muhlia-Almazán）| 阿图罗·桑切斯-帕斯（Arturo Sánchez-Paz）
病毒学实验室。西北生物研究中心（CIBNOR）。埃莫西略校区。墨西哥索诺拉州埃莫西略，邮编83106

**摘要**
海洋生态系统中数量最多、分布最广的浮游植物之一是单细胞蓝细菌——聚球藻属（Synechococcus），它们对海洋初级生产力的贡献巨大。然而，像其他生物一样，聚球藻也会被一种特定的病毒——蓝藻噬菌体感染。这些病毒在世界各地的海洋中广泛存在，通过调节细菌的数量、多样性和生理特性来影响细菌群落。目前关于加利福尼亚湾中感染聚球藻的噬菌体的存在及其对虾养殖生态系统中的宿主种群的影响的信息尚不充分。这一点非常重要，因为它们直接关系到虾的健康和生长，以及养殖场生产力的优化。本研究开发了一种高度特异性和敏感性的qPCR方法，用于定量检测聚球藻及其感染噬菌体的数量。此外，还研究了加利福尼亚湾一个虾养殖场中噬菌体及其宿主的时空分布模式，并探讨了这种相互作用的生态影响。我们的研究结果有助于更好地理解病毒-宿主之间的相互作用，这最终可能影响虾养殖设施周围的初级生产力。

**引言**
在过去的两个世纪里，人们已经明确认识到微生物是生命的基础（Gibbons和Gilbert，2015）。经过数十亿年的进化，微生物通过选择性适应占据了生物圈中的每一个可能的生态位。特别是海洋微生物群落，由病毒、细菌、古菌、真菌、原生动物和微浮游生物等多种物种组成，在海洋环境的健康、生态和生物地球化学过程中发挥着关键作用（Ladau和Eloe-Fadrosh，2019）。这些复杂且高度结构化的群落通过长期的相互作用共同进化（Gorter等人，2020）。病毒和细菌常常共存于同一生态位，这种共存促进了它们之间的直接和间接相互作用，从而增强了它们的适应性，进一步推动了它们的共同进化（Stern和Sorek，2011）。因此，研究病毒-细菌的动态对于理解塑造海洋微生物数量和多样性的生态和进化力量至关重要。
大多数现代研究表明，海洋浮游植物贡献了全球近一半的初级生产力（约50 Gt C·yr-1）（Kulk等人，2020；Johnson和Bif，2021）。然而，越来越多的证据表明，聚球藻及相关微浮游植物是海洋初级生产力的主要贡献者（Bec等人，2005；Cotti-Rausch等人，2020；Paerl等人，2020）。微浮游植物主要包括三个主要类群：原绿球藻（Prochlorococcus）、聚球藻（Synechococcus）和微真核浮游植物（picoeukaryotic phytoplankton）（Visintini等人，2021），其中微蓝细菌约占海洋碳固定的25%（Flombaum等人，2013）。由于微蓝细菌能够固定二氧化碳并合成有机碳，这些碳随后被整合到更高营养级的生物体内，因此它们被认为是海洋食物网中的关键组成部分（Bemal和Anil，2019；Hess等人，2016）。
这种单细胞微蓝细菌的全球数量约为7 × 10^26个细胞，是地球上第二丰富的浮游植物类群（Flombaum等人，2013；Doré等人，2022），并且在全球海洋中普遍存在。尽管之前认为聚球藻对低温的耐受性较低，但最近的研究表明它也存在于极地海域（Parli等人，2021；Paulsen等人，2016）。聚球藻的广泛分布很可能与其出色的适应能力有关。聚球藻属成员拥有超分子光捕获复合体——藻胆体（phycobilisomes），其中包含三种不同类型的色素（类型1至3），这些色素具有不同的藻胆蛋白组成（Six等人，2007；Sato等人，2024；Zheng等人，2025）。根据藻胆体的结构，聚球藻被分为三种类型：类型1仅含有藻蓝蛋白（PCB）；类型2的藻胆体同时含有藻蓝蛋白和藻红蛋白（PEB）；类型3的藻胆体含有藻红素（PUB）、PCB和PEB（Xia等人，2020）。含有藻红蛋白的聚球藻通常出现在温暖、中营养到富营养的沿海水域。
多项研究考察了加利福尼亚湾不同区域的聚球藻地理分布及其数量（Díaz和Maske，2000；Martínez-López等人，2023；Toledo和Palenik，1997）。最近的研究在虾养殖池塘和白腿虾（Penaeus vannamei）的肠道微生物群中发现了聚球藻（Alfiansah等人，2018；Fan等人，2019；Hou等人，2020；Zeng等人，2017）。这些发现很重要，因为新的证据表明某些聚球藻菌株可能是毒素的潜在来源（Gin等人，2021），可能对海洋无脊椎动物（包括虾）和人类健康造成影响（Flombaum等人，2013；Jasser和Callieri，2016；Martins等人，2007；Martins等人，2008）。
先前的研究表明，聚球藻的自然种群主要受异养纳米鞭毛藻的调控（Christaki等人，2002；Tsai等人，2007）；然而，Dolan和?imek（1999）发现纳米鞭毛藻的摄食活动仅能去除0.2%至1%的聚球藻。此外，有证据表明病毒裂解是聚球藻死亡的关键因素。Suttle和Chan（1994）发现，在离岸地区，被蓝藻噬菌体感染的聚球藻细胞比例约为5-14%，而在沿海水域，每天有超过80%的聚球藻细胞被感染。
感染蓝细菌的噬菌体属于有尾噬菌体纲（Caudoviricetes），这类噬菌体具有二十面体衣壳和双链DNA（dsDNA）基因组（Turner等人，2023）。蓝藻噬菌体具有丰富的宿主多样性，其宿主特异性存在显著差异，这反映了这些噬菌体的遗传多样性与宿主种群之间的密切关系（Grasso等人，2022；Jassim和Limoges，2013；Morimoto等人，2019）。越来越多的证据表明，感染海洋聚球藻的噬菌体在淡水和海洋环境中广泛存在且数量众多，重组和一些环境因素对其多样性有重要影响（Baran等人，2022；Huang等人，2012；Jameson等人，2011；Kupczok和Dagan，2019；Maidanik等人，2022；Malits等人，2021）。因此，感染聚球藻的噬菌体因其对聚球藻生物量、种群结构和分布的显著影响而备受关注。
众所周知，海洋病毒的丰度及其与宿主的相互作用可能受到多种环境因素的调控，如盐度和温度（Encinas-García等人，2024；Finke等人，2017；Kukkaro和Bamford，2009）。此外，海洋中的病毒动态取决于微生物宿主群落的丰度和组成（McMinn等人，2020）。然而，尽管蓝藻噬菌体在海洋环境中非常重要，但关于影响聚球藻感染噬菌体数量及其在虾养殖场表层水中动态的研究仍然很少。此外，关于加利福尼亚湾中蓝藻噬菌体存在、数量和分布的定量研究也非常有限。
本研究的意义在于其聚焦于加利福尼亚湾——该地区以其卓越的海洋生物多样性和高初级生产力而闻名（Morzaria-Luna等人，2018），这种生产力支持着复杂的多层次食物网（Mercado-Santana等人，2017）。此外，加利福尼亚湾对墨西哥经济至关重要，支撑着该国最重要的渔业和水产养殖活动（Arreguín-Sánchez等人，2017）。因此，目前关于加利福尼亚湾特定病毒与宿主系统相互作用的研究仍然很少。
由于理解塑造微生物群落的机制至关重要，本研究旨在开发并验证一种高度特异性和敏感性的qPCR方法，用于检测和定量聚球藻及其感染噬菌体的数量。此外，本研究还研究了加利福尼亚湾一个虾养殖场中噬菌体及其宿主的时空分布模式。这些结果将有助于更好地理解病毒-宿主之间的相互作用，从而可能影响这些养殖设施周围的初级生产力。

**方法部分**
**用于检测和定量聚球藻的引物设计**
由于藻红蛋白（PE）是海洋聚球藻的主要光捕获色素，因此选择编码PEI的基因序列作为检测这种蓝细菌数量的候选序列。从NCBI GenBank数据库中检索了来自不同地理区域的13个聚球藻基因序列（表1）。这些全长序列使用MAFFT v7.526中的L-INS-i算法进行了比对（Katoh和Standley，2013）。随后，设计了特定的引物。

**检测验证**
FastPCR软件预测的引物特性见表3。PCR模拟显示，用于检测聚球藻的引物可产生137 bp的扩增产物，退火温度为69°C。需要注意的是，由于这些引物针对的是该蓝细菌的藻红蛋白编码基因片段，因此它们只能检测类型2和类型3的聚球藻菌株。虽然这可能成为研究的限制，因为它无法同时检测所有类型的聚球藻。

**结论**
本研究成功开发、验证并应用了一种特异性和敏感性的qPCR方法，用于定量检测虾养殖环境中的聚球藻及其感染噬菌体。严格设计的引物针对宿主藻红蛋白编码基因和噬菌体头尾连接基因，在计算机模拟中表现出良好的热力学特性。后续的体内验证证实了其高特异性和效率。

**致谢**
作者感谢CIBNOR埃莫西略分部的Juan Vega Peralta工程师、Rosa María Valenzuela工程师、Rodolfo Barraza工程师和Alfredo Barreras Torres的宝贵支持。作者还要感谢UNAM生物技术研究所DNA合成与测序部门的Jorge Arturo Yanez Ponce de León、Ruben Paul Gaytán Colín和Eugenio López Bustos在引物合成方面所做的辛勤工作。