《Journal of Virological Methods》：A universal RdRp-targeted primer set for broad, non-specific detection of Quinvirinae and other Betaflexiviridae infecting stone fruits
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Michele Digiaro|Antonella Karam|Pasquale Venerito|Amani Ben Slimen意大利巴里地中海农业研究所，Via Ceglie 9，70010 Valenzano（巴里）摘要高通量测序技术扩展了已知感染核果植物的Betafle
Michele Digiaro|Antonella Karam|Pasquale Venerito|Amani Ben Slimen
意大利巴里地中海农业研究所，Via Ceglie 9，70010 Valenzano（巴里）
摘要
高通量测序技术扩展了已知感染核果植物的Betaflexiviridae科病毒多样性，尤其是Quinvirinae亚科，这使得基于物种特异性引物的常规诊断变得复杂。在这项研究中，通过比对Robigovirus和Foveavirus的公共序列（每种病毒有4-5个分离株），设计了一组针对RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）保守区域的通用退化引物，并评估其能否广泛、非特异性地检测核果植物及某些非李属宿主中的多种Betaflexiviridae病毒。该检测方法在以下样本上进行了验证：(i) CNRMV、CGRMV、CRMaV、PVGR、WCaV、ApLV的参考株；(ii) 当地收集的Prunus样本（n = 449）；(iii> 非Prunus宿主，如梨（ASPV）和葡萄（GRSPaV）。首先使用通用RT-qPCR（SYBR Green）进行筛查，然后通过常规RT-PCR和Sanger测序（约280个核苷酸）进行物种鉴定和确认。在449个Prunus样本中，有45个（10.0%）对qPCR呈阳性，并通过RT-PCR获得了预期大小的扩增产物。感染率最高的是甜樱桃（20.0%，30/150），其次是杏（13.3%，8/60）和桃（5.4%，7/130）；李子未检测到感染。BLAST分析结果显示：21个Robigovirus阳性样本（樱桃中13个PVGR；樱桃、桃、杏中各8个CGRMV），4个Foveavirus（杏和桃中各1个ApLV；杏和桃中各1个APV2），19个CVA（Capillovirus）；樱桃中14个，杏和桃中5个AVCaV（Prunevirus）；此外，在梨中检测到ASPV，在葡萄中检测到GRSPaV。这套基于RdRp的引物组合能够广泛检测Quinvirinae亚科及部分Trivirinae亚科病毒，简化了核果健康计划的大规模筛查和一线诊断工作。通过Sanger测序或二次物种特异性RT-PCR可以轻松实现物种级别的分辨率，适用于监测、认证和检疫。
引言
高通量测序（HTS）技术的进步大大扩展了感染核果植物（Prunus属）的病毒种类目录，使得能够在无症状宿主体内检测到病毒并快速进行基因组分析。新发现的病毒大多属于Betaflexiviridae科，该科病毒具有丝状、弯曲的颗粒结构和单链正链RNA基因组，末端带有poly(A)尾基。该科目前包含多个属，根据基因组结构分为两个亚科：Trivirinae（通常包含三种主要蛋白：复制酶、30K移动蛋白和衣壳蛋白）和Quinvirinae（五种主要蛋白：复制酶、TGB1-3和衣壳蛋白）。
在Betaflexiviridae科中，不同物种的区分通常依赖于CP或复制酶/RdRp基因的72%核苷酸同一性或80%氨基酸同一性，而不同属之间的基因同一性约为45%（Adams等人，2011年）。
迄今为止，已有超过二十种被正式认可的Betaflexiviridae科病毒被报道为核果植物的致病因子，这些病毒属于Foveavirus、Robigovirus、Trichovirus、Capillovirus、Prunevirus和Tepovirus属（Rubino，2024年；Debat等人，2026年）。此外，还有许多其他潜在病毒物种等待正式分类，例如Robigovirus属的Turkey樱桃病毒（CVTR）（?a?layan等人，2019年）、Cherry robigovirus 5（CRV5）（Wu等人，2019年）、Greece苹果病毒（PVGR）（Costa等人，2022年）和Wild cherry相关病毒（WCaV）（Ben Slimen等人，2026年）；Foveavirus属的Asian prunus病毒3（APV3）（Marais等人，2006年）等。
Betaflexiviridae科在核果植物中的多样性不断增加，尤其是Quinvirinae亚科，加上物种内部的高度变异，使得基于物种特异性引物的广泛、经济有效的诊断变得复杂。本文研究设计了一组针对保守RdRp结构域的通用引物，以实现非特异性检测。我们在来自阿普利亚两个种质库的多种Prunus材料以及梨和葡萄宿主上验证了该检测方法，分别用于检测苹果茎凹陷病毒（Foveavirus mali）和葡萄rupestris茎凹陷相关病毒（Foveavirus rupestris，即GRSPaV）。
章节片段
样本采集
2024年秋季，在意大利南部的阿普利亚地区两个地点采集了植物样本：
- CRSFA “Basile Caramia”种质库（Locorotondo），包含124棵樱桃树、102棵李子树、118棵桃树和55棵杏树（每种3-3个生态型/品种）；
- CIHEAM巴里保护中心（Valenzano），这是一个在阿普利亚地区选定的原始样本储存库（26棵樱桃树、7棵李子树、12棵桃树、5棵杏树）。
从每个样本中选取3-4根枝条进行采样，以减少树内变异。
通过RT-qPCR和RT-PCR检测核果植物中的病毒
所有已知感染的Prunus样本均被本研究中设计的通用引物deg1成功检测到。随后使用相应的物种特异性引物进行的RT-PCR进一步确认了病毒感染（图2）。
使用相同的deg1引物对449个不同植物物种的野外样本进行qPCR分析，发现45个样本具有阳性扩增曲线，并在79-80°C处出现单一特异性熔解峰。
讨论
RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）是RNA病毒的特征蛋白，在基因组复制和转录中起核心作用。由于其与其他病毒蛋白相比具有较高的保守性，RdRp被广泛用作Betaflexiviridae科成员的系统发育和进化标记（Venkataraman等人，2018年；Silva等人，2021年；Rastgou等人，2022年；Ramaswamy等人，2022年）。与甲基转移酶（Mtr）和解旋酶相关的保守基序
结论
我们提出了一种基于RdRp的通用检测方法，能够广泛、非特异性地检测核果植物中的Betaflexiviridae病毒，对Robigovirus和Foveavirus的检测效果显著，并且与CVA和AVCaV具有交叉反应性。该方法简化了大规模筛查和一线诊断流程，同时可以通过Sanger测序或物种特异性RT-PCR实现物种级别的分辨率。其实用性使其适用于监测、认证和检疫。
伦理声明
植物采样是在获得许可的机构收藏库中进行的，未涉及任何濒危物种。
资金来源
本研究未获得公共部门、商业部门或非营利组织的任何特定资助。
Michele Digiaro：撰写——初稿、监督、研究、概念构思。Antonella Karam：正式分析。Pasquale Venerito：资源提供。Amani Ben Slimen：撰写——审稿与编辑、验证、方法学设计、数据管理。
作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢INRAE（法国波尔多）和UCD（美国戴维斯）提供参考样本，以及CRSFA和CIHEAM巴里提供种质资源。
