皂荚属(Gleditsia)绒毛皂荚(G. japonica var. velutina)叶绿体基因组特征及其属内变异与系统发育进化启示

《Ecology and Evolution》：Chloroplast Genome Insights of Gleditsia japonica var. velutina and Evolutionary Implications for Variation and Phylogeny in Gleditsia

　　

摘要：皂荚属（Gleditsia，豆科Fabaceae：云实亚科Caesalpinioideae）具有重要药用价值，而中国特有变种绒毛皂荚（G. japonica var. velutina）处于受威胁状态。研究人员整合Nanopore长读长（long-read）与Illumina短读长（short-read）测序技术组装了绒毛皂荚完整叶绿体基因组（chloroplast/cp genome），并对其进化特征进行系统分析。结果表明，皂荚属内cp基因组大小变异（162.4–170.8 kb）主要由大单拷贝区（large single-copy, LSC）重复序列扩张驱动。全基因组比较揭示了可作为属内尤其是濒危绒毛皂荚物种界定（species delimitation）潜在新型分子标记的超高变基因间隔区（hypervariable intergenic regions）和多态基因（polymorphic genes）。比较分析进一步显示密码子使用偏性（codon usage bias, CUB）主要受自然选择塑造且在属内高度保守，鉴定出30个最优密码子（optimal codons）。系统基因组学（phylogenomics）分析支持G. japonica var. velutina与G. japonica var. delavayi及G. japonica亲缘关系密切。本研究首次对极危（Critically Endangered）绒毛皂荚进行全面的cp基因组分析，阐明其在皂荚属内的进化分歧，为其保护提供坚实基因组基础。

论文解读：《皂荚属(Gleditsia)绒毛皂荚(G. japonica var. velutina)叶绿体基因组特征及其属内变异与系统发育进化启示》

皂荚属（Gleditsia，Fabaceae: Caesalpinioideae）主要分布于亚洲及美洲温带、亚热带地区，具重要药用价值，富含黄酮、生物碱及三萜皂苷等活性成分。其中，中国特有变种绒毛皂荚（G. japonica var. velutina）野生个体不足10株，仅存于湖南衡山溪谷，被列为国家一级重点保护野生植物及IUCN极危（CR）等级。其雌雄异熟（dichogamy）导致自然授粉效率低，加之种皮透水性差致使天然萌发率极低，面临严峻灭绝风险。有效的保护策略依赖对其遗传背景与进化关系的认知。叶绿体（chloroplast, cp）基因组具低重组率、母系遗传、进化速率适中之特点，是物种鉴定（DNA barcoding）与推断深层进化历史的重要工具。此前皂荚属cp基因组已有零星报道，但针对濒危绒毛皂荚的高质量完整cp基因组解析及基于多物种比较的属内进化模式、分类地位争议（G. japonica var. delavayi是否应独立为种）尚不明晰，且短读长测序难以准确拼接长重复区域。为此，研究人员采用Nanopore长读长联合Illumina短读长混合测序策略，首次获得绒毛皂荚完整cp基因组并与已发表皂荚属其他5个分类群（G. japonica、G. japonica var. delavayi、G. fera、G. microphylla、G. sinensis）进行全基因组比较、密码子使用偏性分析、重复序列及序列分歧度评估，并基于全cp基因组重建云实亚科系统树，以揭示属内进化关系、基因组大小变异机制及适用于濒危种鉴定的分子标记，为该极危植物保护提供遗传学依据。该论文发表于《Ecology and Evolution》。

主要关键技术方法：

研究人员采集南京中山植物园栽培的绒毛皂荚（G. japonica var. velutina）活体幼苗新鲜叶片（凭证标本保存于中国科学院南京中山植物园标本馆，编号NAS00818519），提取总基因组DNA后分别构建Illumina NovaSeq 6000平台短插入片段文库（≥50×覆盖度）与Oxford Nanopore Technologies PromethION R10.4.1长读长文库（SQK-LSK109建库）。cp基因组初步由Nanopore数据经PtGAUL组装，再用Illumina数据通过Pilon进行校正与抛光；注释借助CPGavas2在线平台初注，经GeSeq与Geneious Prime手动校对。从NCBI下载5个近缘种cp基因组作比对。密码子使用偏性（codon usage bias, CUB）通过CodonW、EMBOSS计算GC3s（第三密码子位置GC含量）、有效密码子数（effective number of codons, ENC）、相对同义密码子使用度（relative synonymous codon usage, RSCU）及同义密码子使用序（synonymous codon usage order, SCUO），并用coRdon计算MILC（measures independent of length and composition）；ENC-plot、PR2-plot（Parity Rule 2）及中性作图（neutrality plot）分析突变压力与自然选择贡献。串联重复（tandem repeats）用Tandem Repeats Finder识别，散在重复（dispersed repeats）用REPuter检测（≥30 bp，≥90%相似度），简单重复序列（simple sequence repeats, SSRs/microsatellites）用MISA鉴定。序列分化用mVISTA进行共线性可视化，DnaSP计算核苷酸多样性（Pi），TBtools计算非同义替换（Ka）与同义替换（Ks）比值；IR边界用IRscope分析。系统发育重建选用大豆（Glycine max，NC_007942）为外类群，经PhyloSuite提取分区、MAFFT比对、TrimAl修剪，JModelTest按AIC选定GTR+I+G模型，最大似然法（Maximum Likelihood, ML）用PhyML（1000次自举Bootstrap）与贝叶斯推断（MrBayes, MCMC 1×10⁷代，弃前25%老化burn-in）构建系统树。

研究结果

3.1 Complete Chloroplast Genome of G. japonica Var. velutina（绒毛皂荚完整叶绿体基因组）

研究人员通过混合测序组装获得绒毛皂荚环状cp基因组全长166,424 bp，具典型四分体结构：大单拷贝区（LSC）94,841 bp、小单拷贝区（SSC）19,503 bp、反向重复区（inverted repeat, IR_a/IR_b）各26,040 bp。总GC含量34.8%，注释得到111个唯一基因（含77个蛋白编码基因protein-coding genes、30个tRNA基因、4个rRNA基因），总计130个基因（含IR区重复拷贝）。其中clpP与ycf3含双内含子，rps12为典型反式剪接（trans-splicing）结构（外显子1位于LSC，外显子2、3位于IR）。

3.2 Complete Chloroplast Genomes of Gleditsia Species（皂荚属各物种完整叶绿体基因组比较）

比较6个皂荚属分类群cp基因组发现基因数目与排列完全一致，整体GC含量稳定（33.9%–35.6%）。基因组大小差异（162,391–170,796 bp）主要源于LSC区长度变化（90,870–98,889 bp），IR区长度变异极小（26,036–26,619 bp），IR边界扩张/收缩对大小影响微弱；部分分类群rps19完全落入IR区，而G. japonica与G. japonica var. velutina中rps19位于IR/LSC边界，证实LSC重复序列积累是皂荚属cp基因组扩张主因。

3.3 Analysis of Codon Preference（密码子偏好性分析）

六物种RSCU（relative synonymous codon usage）模式高度相似，均鉴定出30个最优密码子（RSCU>1且ΔRSCU>0.08）。SCUO值均<0.5（约0.298），表明CUB较弱；MILC≈0.55，psa与psb基因家族SCUO>0.40示较强偏性。ENC-plot显示多数基因落于期望曲线下方，PR2-plot示A/T与G/C在第三位点上不平衡，中性作图回归斜率对应自然选择贡献81.36%–88.22%、突变压力11.78%–18.64%，表明CUB主要受自然选择驱动并具属内保守性。

3.4 Repeat Analysis（重复序列分析）

散在重复以正向重复（forward repeats）为主，G. japonica var. velutina含最多>200 bp长散在重复。SSR以单核苷酸A/T型为主，富集于LSC与非编码区；G. japonica var. velutina与G. microphylla SSR分布及基序高度一致。编码区SSR保守定位于atpB、ndhF、psbI、rpoB、rpoC2、rps18、ycf1、ycf4。LSC区串联重复累积数与cp基因组大小呈显著正相关，支持LSC重复扩张促基因组增大。

3.5 Genome Sequence Divergence（基因组序列分化分析）

mVISTA与Pi（核苷酸多样性nucleotide diversity）分析显示IR区最保守（平均Pi=0.001），LSC（Pi=0.008）与SSC（Pi=0.011）较高；非编码区Pi均值（0.025）远高于编码区（0.002）。编码区中ycf1核苷酸多样性最高（Pi=0.029）且Ka/Ks（非同义/同义替换比）>1示受正选择（positive selection），其余基因Ka/Ks<1为纯化选择（purifying selection）。高变基因间隔区包括accD–psaI、rps16–trnQ-UUG、psbZ–trnG-GCC、trnR-UCU–atpA、trnT-UGU–trnL-UAA。以绒毛皂荚为参照检测到389–1522个SNP（单核苷酸多态性single nucleotide polymorphism），主要集中于LSC区。

3.6 Phylogenetic Analysis（系统发育分析）

基于全cp基因组构建的云实亚科系统树显示Umtiza支最早分化，Ceratonia siliqua外类群于Gymnocladus–Gleditsia姐妹群（高支持值）；Gleditsia属为单系，其中G. japonica、G. japonica var. velutina与G. japonica var. delavayi聚为一支（高支持），支持三者变种级亲缘关系；G. fera与G. sinensis形成另一姐妹支，G. microphylla单独分出。

讨论与结论总结（翻译/浓缩结论部分）：

本研究通过Nanopore与Illumina混合测序成功组装极危绒毛皂荚高质量完整cp基因组。比较分析表明皂荚属质体基因组具高度保守四分体结构，序列变异与密码子使用偏性模式稳定；cp基因组扩张主要由LSC区重复序列积累驱动而非IR边界漂移，为植物cp基因组大小变异进化机制提供新视角。密码子使用呈明显A/T偏性且受自然选择主导，对基因表达调控作用弱。系统基因组学支持G. japonica var. delavayi与G. japonica var. velutina作为G. japonica变种的分类处理，解决亚洲皂荚属长期分类争议。鉴定出的高变基因间隔区及多态基因（特别是ycf1与ndhF）可作为皂荚属物种界定与鉴定的潜在分子标记（DNA条形码barcode候选），尤其利于濒危绒毛皂荚精准辨识。该研究深化了对皂荚属质体基因组进化的认识，为其后续分类学、群体遗传学及保护遗传学研究提供重要基因组资源。