《Environmental DNA》：Passive eDNA Sampling as a Promising Tool for Standardizing Wetland Biodiversity Assessments
编辑推荐：
环境DNA（eDNA）宏条形码（metabarcoding）是一种广泛应用于各种生态系统生物多样性评估的方法。在水生环境中，eDNA通常通过主动水过滤（active water filtration）收集，这需要专业设备，且在浑浊水体中具有挑战性。本研究评估了
环境DNA（eDNA）宏条形码（metabarcoding）是一种广泛应用于各种生态系统生物多样性评估的方法。在水生环境中，eDNA通常通过主动水过滤（active water filtration）收集，这需要专业设备，且在浑浊水体中具有挑战性。本研究评估了一种替代方法在静水淡水（lentic freshwaters）中的效率，该方法基于被动eDNA采样（passive eDNA sampling），即将低成本DNA陷阱（DNA traps）配备三种收集材料（硝酸纤维素cellulose nitrate、玻璃纤维glass fiber和咖啡滤纸coffee filters）浸没在淡水池塘中。研究人员将结果与同时同地点进行的主动过滤进行直接比较。采用多重PCR（multiplex PCR）方法针对水生植物（macrophytes）、大型无脊椎动物（macroinvertebrates）和脊椎动物（vertebrates）鉴定淡水群落。结果表明，在检测水生植物物种方面，被动采样总体上与主动过滤相当，在ASV（amplicon sequence variant，扩增子序列变体）计数、物种丰富度（species richness）或香农多样性（Shannon diversity）上无显著差异。对于脊椎动物，被动采样恢复了相似的物种丰富度和ASV计数，尽管主动过滤产生了更高的香农多样性。对于大型无脊椎动物，在本研究系统中，主动过滤比被动采样恢复了显著更高的物种丰富度和香农多样性，而两种方法在大型无脊椎动物总体恢复上可能受到标记物选择和采样努力的制约。此外，在所测试的收集材料（包括低成本咖啡滤纸）之间未发现eDNA捕获效率的显著差异。研究人员得出结论，由于易于野外部署并结合实验室中多个低成本野外重复的合并，使用DNA陷阱的被动采样提供了可扩展性和灵活性，从而为大规模淡水生物多样性监测提供了比主动过滤更具成本和时间效率的替代方案。
**论文解读：被动eDNA采样在标准化湿地生物多样性评估中的潜力**
**研究背景与问题**
21世纪全球生物多样性丧失严峻，湿地生态系统尤为突出：湿地覆盖地球表面不足1%，但自1700年以来已减少超过75%，当前湿地损失速率是森林损失的三倍以上。湿地（包括池塘等小型静水水体）是内陆淡水系统，高度受威胁，在生物多样性监测和保护计划中常被低估。传统监测方法侵入性强、耗时，需要多位分类学专家，且对稀有或隐蔽物种检测困难。环境DNA（eDNA）宏条形码（metabarcoding）作为非侵入性、成本高效的工具逐渐受关注。然而，最常用的eDNA收集方法——主动水过滤（active water filtration）需专业泵设备，在浑浊水体（如常见于静水水体）中滤膜易堵塞，导致过滤水体积不一致，影响稀有物种检测和样本间可比性。此外，当前仍缺乏标准化的、低成本、易部署的采样方法。因此，有必要探索替代方案。被动eDNA采样（passive eDNA sampling）通过将收集材料浸没于水中一定时间捕获eDNA，已在海洋和河流系统中显示潜力，但在静水淡水系统中的适用性尚待验证。本研究旨在首次测试被动eDNA采样是否适用于静水淡水（lentic freshwater）中多个目标分类群（水生植物、大型无脊椎动物、脊椎动物）的eDNA收集，并评估其与主动过滤的一致性；同时测试三种收集材料（包括低成本咖啡滤纸）的效果。
**关键技术与方法**
研究在法国莱茵河洪泛区的一个浅层浑浊淡水池塘（水体体积700 m3）进行，设置7个采样点。主动过滤使用吸血鬼采样器（vampire sampler）和0.45 μm聚偏二氟乙烯膜Sterivex胶囊，过滤目标1 L水但因堵塞平均仅430 mL。被动采样使用自制DNA陷阱（塑料网包裹收集材料，浮于水面下约10 cm），装备三种圆形收集材料（直径47 mm）：硝酸纤维素膜（0.45 μm）、玻璃纤维滤膜（1.2 μm）和普通咖啡滤纸，浸没6小时。所有样本（主动14个，被动21个）及阴性对照经高盐提取法获取eDNA，使用Quantus荧光计定量。采用多重PCR策略：一个反应中同时扩增水生植物（rbcL标记，379 bp）和大型无脊椎动物（COI标记，350 bp），另一个反应扩增脊椎动物（12S-V5标记，98 bp）。PCR前将模板DNA归一化至0.2 ng/μL以增强可比性。文库构建采用PCR-free单步标记，在Illumina NovaSeq 6000测序。生物信息学处理使用ObiTools4进行合并、质控、去噪和ASV聚类，利用定制化的欧洲物种参考数据库（结合NCBI、EMBL、MitoFish等）进行物种分配。统计分析使用R，包括配对t检验、Wilcoxon符号秩检验、ANOVA、Friedman检验、PCoA、Procrustes分析和重采样PERMANOVA，比较主动与被动方法的eDNA量、ASV计数、物种丰富度、香农多样性和群落组成。
**研究结果**
**3.1 eDNA量：主动过滤与被动采样的比较**
提取的eDNA浓度在主动过滤和被动采样间存在极显著差异（Wilcoxon检验，p < 0.001），主动样本平均eDNA量为被动样本的40倍。然而，在三个分类群的ASV计数上，两种方法均无显著差异（水生植物：配对t检验，p = 0.54；大型无脊椎动物：p = 0.13；脊椎动物：Wilcoxon检验，p = 0.81），表明尽管被动采样总DNA量低，但序列捕获效率与主动过滤相当。
**3.2 多样性与群落组成：主动过滤与被动采样的比较**
主动过滤共检测到35个物种（11种水生植物、13种大型无脊椎动物、11种脊椎动物），被动采样检测到30个物种（9种水生植物、10种大型无脊椎动物、11种脊椎动物）。基于Jaccard相异度的主坐标分析（PCoA）显示采样方法在第一维度上对群落结构有适度影响，Procrustes分析表明两种方法间有中等一致性（r = 0.76，但p = 0.081不显著）。对于水生植物和脊椎动物，物种丰富度在两种方法间无显著差异（水生植物：配对t检验，p = 0.639；脊椎动物：Wilcoxon检验，p = 0.17）；但对于大型无脊椎动物，主动过滤显著高于被动采样（Wilcoxon检验，p = 0.034）。香农多样性指数方面，水生植物无显著差异（p = 0.955）；大型无脊椎动物和脊椎动物中，主动过滤显著更高（大型无脊椎动物：配对t检验，p = 0.026；脊椎动物：p = 0.049）。物种积累曲线显示，对于水生植物和脊椎动物，被动采样曲线趋于饱和，而主动过滤始终处于更高水平；大型无脊椎动物两种方法均未达到平台期，说明均未充分捕获其多样性。
**3.3 三种被动采样材料的比较**
硝酸纤维素、玻璃纤维和咖啡滤纸三种收集材料在eDNA提取量（Friedman检验，p = 0.717）、ASV计数（各分类群及合并数据集均无显著差异，p均>0.05）、物种丰富度（各分类群及合并数据，p均>0.05）和香农多样性（合并数据，Friedman检验，p = 0.368）上均无显著差异。Procrustes分析显示三种材料的两两配对群落排序间有中等一致性，但均不显著（r在0.606-0.655之间，p > 0.3）。这表明在6小时浸没条件下，被动采样材料间的eDNA捕获效率差异不大，包括低成本咖啡滤纸。
**总结讨论与结论**
研究表明，被动eDNA采样在静水池塘中可成功收集eDNA，且对水生植物和脊椎动物的检测效果与主动过滤相当，但对大型无脊椎动物，主动过滤仍表现更优。大型无脊椎动物检测受限可能源于所用COI引物偏倚（低简并度）以及田野复制数不足；两种方法均未充分恢复其多样性，但主动过滤在本系统内显著更优。被动采样中eDNA主要依靠吸附而非孔径筛选，这解释了材料间差异不显著的原因。研究还发现，6小时浸没时间在信号积累和降解间取得平衡；延长浸没可能促进生物膜形成，增加降解风险。被动采样在时间投入上比主动过滤节省约85%，且材料成本低，尤其咖啡滤纸可进一步降低成本。研究建议，未来应针对大型无脊椎动物优化引物组和田野复制数，并探索更长的浸没时间或避免DNA归一化以提升稀有物种检测。总体而言，被动eDNA采样为静水淡水系统的大规模生物多样性监测提供了可扩展、灵活且经济的替代方案。
**研究结论翻译**：本研究突显了被动eDNA采样作为静水淡水系统基因组生物监测中主动水过滤的高效替代方案。在本研究系统（小型静水池塘，6小时部署时间）中，被动采样对水生植物和脊椎动物表现与主动过滤相当，而对大型无脊椎动物主动过滤表现更优。在测试的各种收集材料（包括低成本咖啡滤纸）中，被动采样器的eDNA捕获效率无显著差异。尽管主动水过滤获得更高的eDNA浓度，但eDNA质量与被动采样相当。此外，被动采样提供了灵活性、可扩展性和减少的野外工作量，使其在资源有限环境下尤其实用，适用于大规模采样。未来研究应针对水体体积优化浸没时间和田野复制数，以增强生物多样性评估，这对大型无脊椎动物尤为必要，因为其物种恢复不彻底，且标记选择和物种特异性eDNA特性可能限制两种方法的检测，而本系统中被动采样恢复了较低的丰富度和香农多样性。扩展引物组和改进陷阱设计（如更大或更多的收集材料面积）可提升eDNA收集。测试更长浸没时间或避免eDNA归一化可能有所帮助，但需管理PCR抑制剂风险。尽管如此，使用低成本材料（如咖啡滤纸）结合被动采样的可扩展性和经济性，使其成为大规模生物多样性研究以及再引入监测或生物入侵早期预警系统等应用中有前景的方法。
