《The Lancet Microbe》：Widespread circulation of Alongshan virus in Austria and serological evidence for infection in humans: a nationwide molecular and serological observational study
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背景Alongshan病毒是一种分节段RNA病毒，属于黄病毒科（Flaviviridae）Jingmen病毒群（Jingmenvirus group），于2017年首次在中国出现蜱传脑炎样症状的患者中鉴定。此后，该病毒已在多个欧洲国家的蜱和哺乳动物中检出。在本
背景Alongshan病毒是一种分节段RNA病毒，属于黄病毒科（Flaviviridae）Jingmen病毒群（Jingmenvirus group），于2017年首次在中国出现蜱传脑炎样症状的患者中鉴定。此后，该病毒已在多个欧洲国家的蜱和哺乳动物中检出。在本研究中，研究人员旨在通过全国性蜱监测，结合对疑似蜱传脑炎或蜱暴露个体的血清学和分子筛查，描述Alongshan病毒在奥地利的时间和地理分布特征。方法在这项全国性分子和血清学观察性研究中，研究人员于2024年使用拖旗法、动物宿主及公民提交样本，对奥地利全境收集的蜱进行了基于PCR的筛查。研究人员还汇总了先前监测研究中2005年和2013年奥地利蜱样本存档核酸提取物以及2015年至2018年间收集的配对蜱-人样本的存档提取物中的基因组数据。对Alongshan病毒阳性的蜱样本进行了全基因组测序和系统发育分析。除蜱样本外，还对奥地利国家人类虫媒病毒参考中心（National Reference Center for Human Arbovirus Infections, Austria）提交的具有报告蜱叮咬史或疑似蜱传脑炎的奥地利患者血样进行了Alongshan病毒感染筛查，并进行了血清学和分子检测。结果2024年2月1日至2024年12月6日期间，从奥地利35个NUTS-3区域中的29个（83%）区域收集了2952只蜱；Alongshan病毒的中位检出率为1·2%（IQR 0·4–3·5）。此外，分析了1816份存档蜱样本，其中三份检出Alongshan病毒阳性。对病毒阳性样本的系统发育分析显示，奥地利序列归类于欧洲支系（European clade），且来自同一地区的奥地利序列表现出高度序列相似性。研究人员评估了2023年3月1日至2025年5月16日期间收集的1361份人血清样本中抗Alongshan病毒IgG抗体的存在情况。两名个体表现出针对Alongshan病毒蛋白VP1a和VP2的高抗体滴度。解释研究显示，在可追溯至2005年的存档蜱样本中检测到Alongshan病毒，这代表了该病毒迄今最早的有文献记载的出现，表明Alongshan病毒已在奥地利传播至少二十年。在两名个体中检测到Alongshan病毒特异性抗体滴度提示既往感染及先前未被识别的暴露。这些结果凸显了持续对蜱种群进行分子监测以及对人类进行血清学监测的必要性，以确定Alongshan病毒在欧洲的流行病学和公共卫生意义。资助One Health surveillance and Vector monitoring for cross-border pathogens (OH SURVector) 和 UNITED4Surveillance。
**研究背景与意义**
Alongshan病毒（Alongshan virus, ALSV）属于黄病毒科（Flaviviridae）Jingmen病毒群（Jingmenvirus group），是一种分节段正链RNA病毒，其基因组包含四个片段，分别编码非结构蛋白（NS5样、NS2B/NS3样）及推定的结构蛋白（VP1a、VP1b、VP2、VP3）。该病毒于2017年首次在中国东北地区蜱传脑炎（tick-borne encephalitis, TBE）样发热患者中分离，随后在俄罗斯、芬兰、德国、瑞士、法国、波兰、西班牙等欧亚国家的蜱及哺乳动物中检出。然而，Alongshan病毒在中欧地区的地理分布、遗传多样性及人类暴露程度尚不清楚：欧洲是否存在持续性传播？人类感染风险是否被低估？现有监测多局限于局部区域，缺乏全国性时空动态分析。为此，研究人员开展了一项全国性分子与血清学观察性研究，旨在通过奥地利全境蜱筛查及人类样本检测，明确ALSV的分布特征、进化关系及人感染血清学证据。该研究发表于《The Lancet Microbe》。
**主要关键技术方法**
1. **蜱样本采集与检测**：2024年通过拖旗法（flagging）、动物宿主（宠物、牲畜、野生动物）及公民科学项目（citizen science project）收集奥地利全境蜱，覆盖35个NUTS-3区域中的29个；同时分析2005年、2013年及2015–2018年存档蜱核酸提取物（来源自奥地利国家监测项目）。
2. **病毒核酸检测**：采用靶向片段1（NS5样NSP1基因）和片段4（假定的膜蛋白VP3基因）的TaqMan RT-qPCR及巢式PCR，阳性样本经Sanger测序或全基因组测序（Illumina MiSeq，用tiled-amplicon方法）确认。
3. **系统发育分析**：基于全基因组序列（MAFFT比对、IQ-TREE最大似然法、1000次自举检验），分析奥地利序列与全球参考序列（中国、俄罗斯、蒙古及欧洲其他地区）的进化关系。
4. **血清学检测**：表达重组ALSV蛋白VP1a（截短至416氨基酸）和VP2（果蝇S2细胞系统，Strep-Tactin亲和纯化），建立间接IgG ELISA及微捕获IgM ELISA，以保守统计阈值（Frey方法，99.9百分位）判定抗体阳性，并进行滴定确认。
**研究结果**
- **Alongshan病毒在奥地利蜱中的分布与流行**
2024年共检测2952只蜱，其中19份Ixodes ricinus蜱样本（来自上奥地利、下奥地利、施泰尔马克、福拉尔贝格四个联邦州的7个NUTS-3区域）呈ALSV阳性，中位检出率为1·2%（IQR 0·4–3·5）。存档样本（n=1816）中，三份来自2005年（福拉尔贝格Feldkirch）和2018年（下奥地利Zwettl、维也纳）的样本阳性。这是目前已知ALSV最早的有文献记载的出现（2005年），表明病毒在中欧至少已流行二十年。
- **病毒基因组特征与系统发育**
对22份阳性样本中的14份（64%）获得完整基因组序列。系统发育分析显示，奥地利所有序列归入Jingmen病毒群中的Alongshan病毒组，并与瑞士、德国、法国、芬兰的毒株共同构成欧洲支系（European clade），与中国、蒙古、俄罗斯的亚洲支系（Asian clade）明确分离。欧洲支系共享15个独特的氨基酸替换位点。来自同一地理区域（如Feldkirch）的2005年与2024年毒株序列一致性高达99·8%，而相距仅数公里的不同区域毒株（如Ried与Braunau）间序列相似性低至95·0%，提示病毒在局部区域持续演化，但不同区域间可能通过候鸟携带的蜱独立引入。
- **人类血清学证据**
对2023年3月至2025年5月期间奥地利国家人类虫媒病毒参考中心收到的1879份患者血清（含584份有蜱叮咬或发热史者）及85份无症状供者血清进行ALSV RNA检测（RT-PCR），均未检出病毒RNA。对其中1361份样本进行抗VP1a IgG ELISA初筛，3份样本反应值>1000 AU；进一步对VP1a和VP2进行滴定确认，两份样本显示高特异性抗体滴度（样本1：抗VP1a滴度414、抗VP2滴度383；样本2：抗VP1a滴度3012、抗VP2滴度836），且IgM阴性、RNA阴性，提示既往感染而非近期感染。异源性Jingmen tick病毒参考血清未与ALSV VP1a发生交叉反应，支持检测特异性。
**讨论与结论**
讨论部分指出，ALSV在奥地利I. ricinus蜱中广泛分布，与欧洲其他国家一致，且2005年即存在，证实其在中欧至少循环二十年。系统发育结果显示局部区域病毒高度保守，但区域间遗传分化较大，与蜱传脑炎病毒（TBEV）的“感染灶聚集模式”类似，可能由候鸟引入所致。人类RNA筛查阴性、仅两例血清学阳性（约1/600），且欧洲ALSV阳性蜱检出率（约1%）低于亚洲（约5%），提示欧洲主要媒介I. ricinus的传播效率可能低于亚洲的I. persulcatus，且人类感染风险较低，但仍构成潜在威胁。研究人员强调需将ALSV纳入蜱传病毒监测及蜱暴露患者鉴别诊断（尤在排除常见病原体后）。
**研究结论翻译**：总之，研究人员的研究结果表明，Alongshan病毒是中欧一种已确立但被忽视的蜱传病毒。其在当地蜱种群中的持续存在凸显了将Alongshan病毒纳入蜱传病毒监测以及蜱暴露患者鉴别诊断的必要性。
