《The FEBS Journal》：Astrocytic connexin43 phosphorylation contributes to seizure susceptibility after mild traumatic brain injury
编辑推荐：
星形胶质细胞（astrocytes）作为脑中的胶质细胞，通过主要由连接蛋白43（Cx43）构成的功能性缝隙连接（GJs）在维持脑稳态中发挥关键作用。这些GJs促进星形胶质细胞之间的电和代谢耦联。Cx43的失调与多种病理相关，包括创伤性脑损伤（TBI）和获得性癫
星形胶质细胞（astrocytes）作为脑中的胶质细胞，通过主要由连接蛋白43（Cx43）构成的功能性缝隙连接（GJs）在维持脑稳态中发挥关键作用。这些GJs促进星形胶质细胞之间的电和代谢耦联。Cx43的失调与多种病理相关，包括创伤性脑损伤（TBI）和获得性癫痫。在轻度TBI/脑震荡后，研究人员之前鉴定出一组与自发性癫痫发作发展相关的非典型星形胶质细胞（atypical astrocytes）。这些星形胶质细胞表现出Cx43表达和耦联的降低。然而，先前研究表明TBI后Cx43蛋白总体增加。Cx43还具有非连接和通道独立的功能，包括与细胞外环境的半通道（hemichannel）通讯。在本研究中，研究人员着手确定轻度TBI如何引发Cx43蛋白表达和定位的改变，这些改变如何被调控，以及它们是否促进癫痫易感性（seizure susceptibility）。研究人员展示了单个星形胶质细胞之间Cx43蛋白水平的显著异质性。一组星形胶质细胞显示出Cx43表达降低，然而总的皮质Cx43蛋白增加。在亚细胞水平上，连接性Cx43保持稳定，而半通道和/或胞质Cx43增加。Cx43在丝氨酸368（serine 368）位点的磷酸化（phosphorylation after mild TBI）——一个关键的调控位点——在轻度TBI后增加。关键的是，在缺乏这种磷酸化的Cx43S368A突变小鼠中，轻度TBI诱导的可溶性非连接Cx43增加和半通道功能增加并未发生。此外，Cx43S368A突变小鼠对戊四氮（pentylenetetrazol, PTZ）诱导的癫痫发作表现出降低的易感性，提示TBI诱导的Cx43S368磷酸化增强了癫痫易感性。研究人员因此预期，抑制这种翻译后修饰可能代表一种潜在的神经超兴奋性和癫痫发作发展的治疗策略。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
星形胶质细胞（astrocytes）通过主要由连接蛋白43（Cx43）构成的缝隙连接（gap junctions, GJs）维持脑稳态，这些GJs介导星形胶质细胞之间的电和代谢耦联。Cx43失调与创伤性脑损伤（TBI）和获得性癫痫等多种病理相关。轻度TBI（mild TBI）后约70%的病例可导致长期后果，如认知障碍和情感调节异常，并增加创伤后癫痫风险。此前，研究人员在轻度TBI模型中发现一组非典型星形胶质细胞（atypical astrocytes），其Cx43表达和耦联降低，并与自发性癫痫发作相关。然而，整体分析显示TBI后Cx43蛋白表达增加，这一矛盾提示Cx43在多细胞群中存在异质性，且Cx43的非连接功能（如半通道通讯）可能参与病理过程。此外，Cx43丝氨酸368（S368）的磷酸化（pCx43S368）在TBI和颞叶癫痫患者及动物模型中升高，但其与癫痫易感性的因果关系尚不明确。因此，本研究旨在阐明轻度TBI如何引发Cx43表达和定位的时空变化，这些变化如何受调控，以及pCx43S368是否直接导致癫痫易感性增加。该研究发表在《The FEBS Journal》。
**主要技术方法**
研究人员采用重量跌落模型（weight drop injury）诱导小鼠弥漫性轻度TBI，使用Western blot（WB）和免疫组化（IHC）检测Cx43蛋白水平及磷酸化状态。通过Triton X-100溶解性分级测定连接性（不溶性）与非连接性（可溶性）Cx43。利用超分辨率共聚焦显微镜（NSPARC系统）量化解剖斑块（plaque）大小和密度。采用溴化乙锭（EtBr）摄取实验评估半通道活性，并应用CBX（广谱缝隙/半通道阻滞剂）和TAT-Gap19（Cx43半通道特异性抑制剂）进行验证。使用Cx43S368A突变小鼠（敲入型S368A替换）研究pCx43S368的作用。采用戊四氮（PTZ）亚抽搐剂量给药评价癫痫易感性。
**研究结果**
**轻度TBI诱导星形胶质细胞Cx43的异质性变化**
通过IHC结合星形胶质细胞特异性报告小鼠（Aldh1l1-tdTomato）确认Cx43几乎完全表达于星形胶质细胞，神经元、小胶质细胞、NG2细胞和血管内皮细胞中极少。WB显示TBI后3天（3 dpi）皮质Cx43总蛋白显著升高，但IHC显示异质性：部分区域Cx43增加，另一些区域降低。平均荧光强度无显著变化，但标准差升高，表明存在离散性改变（即在一亚群星形胶质细胞中Cx43下调，在其他细胞中上调）。
**轻度TBI增加可溶性Cx43水平，而缝隙连接斑块密度不受影响**
通过Triton X-100分级，不溶性（连接性）Cx43在TBI后无明显变化，而可溶性（非连接性）Cx43在3 dpi显著增加，导致可溶/不可溶比例升高。超分辨率成像显示Cx43斑块大小和密度未见改变。结论：Cx43总蛋白增加主要源于半通道和/或胞质Cx43，而非新形成的GJs。
**轻度TBI引起半通道活性增加**
EtBr摄取实验显示，TBI后3 dpi星形胶质细胞核内EtBr荧光强度显著高于假手术组。CBX和Cx43特异性抑制剂TAT-Gap19可将EtBr摄取降至假手术水平，而连接蛋白阻滞剂螺内酯无效。表明EtBr摄取依赖Cx43半通道活性，而非连接蛋白通道。
**Cx43丝氨酸368磷酸化在轻度TBI后增加**
WB检测pCx43S368水平，发现TBI后3 dpi较假手术组显著升高，表明这一翻译后修饰参与了TBI诱导的Cx43改变。
**丝氨酸-丙氨酸替代于Cx43S368不影响脑细胞分布**
Cx43S368A突变小鼠缺乏pCx43S368，通过WB确认pCx43S368免疫检测完全缺失。与野生型C57BL/6J相比，Cx43S368A小鼠的星形胶质细胞、神经元和小胶质细胞密度以及Cx30蛋白水平无显著差异。
**Cx43S368磷酸化影响癫痫易感性**
对未损伤的C57BL/6J和Cx43S368A小鼠进行PTZ亚抽搐剂量注射，C57BL/6J小鼠首次注射后即出现Racine 5级强直-阵挛发作，而Cx43S368A小鼠最早在第4次注射后才出现。累积百分比显示Cx43S368A小鼠癫痫易感性显著降低。在TBI背景下，C57BL/6J小鼠TBI后癫痫易感性进一步增加（第3次注射后62%出现强直-阵挛发作），而Cx43S368A小鼠TBI与假手术组之间无显著差异，且其总体Racine评分和强直-阵挛发作比例均低于野生型TBI组。结论：防止pCx43S368可减轻TBI后PTZ诱导的癫痫发作。
**Cx43S368A小鼠免受TBI诱导的半通道功能改变**
在Cx43S368A小鼠中，TBI后可溶性Cx43未增加，连接性Cx43及可溶/不可溶比例也无显著变化。超分辨率成像显示斑块大小和密度不改变。EtBr摄取实验表明，Cx43S368A小鼠假手术组与TBI组的EtBr荧光强度无差异，且CBX和TAT-Gap19处理后仍无变化。表明pCx43S368是TBI引起半通道活性增加的必要条件。
**总结与讨论**
本研究揭示轻度TBI诱导Cx43蛋白在皮质灰质内的异质性上调，主要体现为非连接性Cx43（半通道及胞质Cx43）的增加，而非缝隙连接结构的改变。Cx43S368位点磷酸化在介导这一过程中起关键作用，通过促进半通道活性增加癫痫易感性。Cx43S368A突变小鼠缺乏该磷酸化，表现出可溶性Cx43无增加、半通道功能无上调以及癫痫易感性降低。尽管存在总Cx43表达降低的混杂因素，但本研究首次从因果角度证明pCx43S368参与TBI后癫痫发生的机制。讨论部分指出，半通道的病理活性可能通过释放谷氨酸、ATP等兴奋毒性物质促进超兴奋性；未来研究需区分缝隙连接与半通道的贡献。研究结论：抑制Cx43S368磷酸化可能作为减轻TBI后神经元超兴奋性和癫痫发作的潜在治疗策略。
