管理光谱流式细胞术中用于肝脏巨噬细胞鉴定的自发荧光

《European Journal of Immunology》：Managing Autofluorescence in Spectral Flow Cytometry for Macrophage Identification in the Liver

　　

生物组织中的自发荧光（AF）源于细胞内和细胞外分子在光吸收后自然发出的光。传统流式细胞术无法校正细胞AF，导致信号失真和测量误差。尽管光谱流式细胞术（Spectral Flow Cytometry）能够可视化和提取AF，但在包含多种具有不同AF特性细胞类型的复杂生物样本（如肝脏）中，准确校正AF仍然具有挑战性。此外，炎症和纤维化等病理过程会改变组织组成并激活特定细胞类型，进一步改变不同实验条件下的AF特征。巨噬细胞（Macrophage）是AF最强的免疫细胞之一，其荧光发射覆盖整个光谱。近期研究已证明，在健康肝脏和代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）中，驻留和招募的巨噬细胞表型具有显著异质性。鉴于巨噬细胞在肝病病理生理学中的关键作用，研究人员应用了一种光谱流式细胞术策略，以更好地分析健康和MASH小鼠肝脏中的巨噬细胞亚群。研究结果表明，健康、脂肪变性及MASH肝脏表现出不同且异质性的AF特征。此外，不充分AF提取会损害肝脏巨噬细胞的准确定量及巨噬细胞亚群的区分。

论文解读：光谱流式细胞术中自发荧光管理对肝脏巨噬细胞鉴定的关键作用

**研究背景与科学问题**

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）及其进展形式代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）已成为全球主要肝病原因，与肥胖密切关联。肝脏作为代谢和解毒核心器官，富含大量自发荧光（AF）分子（如NADPH、维生素A、胶原蛋白等），使其成为体内AF最强的组织之一。传统流式细胞术无法校正细胞AF，导致信号失真和测量误差，例如曾将巨噬细胞的高AF误判为FoxP3表达。光谱流式细胞术虽能可视化并提取AF，但在肝组织这类含有多种细胞类型且AF谱高度异质的复杂样本中，准确校正AF仍面临挑战。此外，病理过程（如炎症、纤维化）会改变组织组成并激活特定细胞类型，进一步使AF特征在不同实验条件间发生漂移。巨噬细胞是肝病发病机制中的核心免疫细胞，近期单细胞RNA测序研究揭示了健康肝脏及MASH期间驻留库普弗细胞（KC）亚群和单核细胞衍生巨噬细胞（MdMs，包括单核-库普弗细胞moKCs和脂质相关巨噬细胞LAMs）的显著异质性。准确识别这些亚群对肝病免疫学至关重要，但AF干扰常导致常规流式细胞术无法有效区分（如LAMs此前主要依赖阴性群界定）。因此，研究人员旨在建立一种适用于高度荧光复杂肝脏样本的光谱流式细胞术分析策略，以可靠地鉴定和定量健康和MASH小鼠肝脏中的巨噬细胞亚群。该论文发表在《European Journal of Immunology》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用以下关键技术方法：1）动物模型：使用C57BL/6小鼠（8-12周龄雄性）和db/db小鼠（10周龄雄性），分别给予MASH饮食（GAN饮食）10周或25周、对照饮食、或胆碱缺乏L-氨基酸定义（CDAA）饮食4周（样本来自荷兰马斯特里赫特大学动物实验委员会批准的实验）；2）肝脏细胞分离与染色：经门静脉灌注PBS后，用胶原酶A和DNase消化肝脏，通过密度梯度离心和红细胞裂解获得单细胞悬液，并进行抗体标记（16色方案，包括CD11b、Ly-6G、Tim-4、CD45、F4/80、MHCII等）；3）光谱流式细胞术与AF提取：在Cytek Aurora全光谱细胞仪（4激光54通道）上采集数据，使用SpectroFlo v3.0.1软件进行解混。AF提取分两种方式：默认AF提取（软件内置）和手动多重AF提取（基于N×N策略手动门控不同AF谱，以相似性指数SI<0.98为区分标准）。参考对照使用荧光珠替代肝细胞，以改善荧光基团解混性能。

**研究结果**

**2.1 多重AF提取与流式珠是正确识别肝脏髓系细胞的关键**

研究人员使用7色面板测试解混策略。默认AF提取（使用肝细胞作为参考对照）无法明确区分Ly6G⁺中性粒细胞和Ly6C⁺单核细胞。改用荧光珠作为参考对照后，相似性矩阵显示荧光基团分离显著改善，但仍仅能识别巨噬细胞群。进一步手动提取健康肝脏中的4个独特AF谱（AF Con-1-4），并将其作为荧光标签加入解混后，清晰定义了中性粒细胞和单核细胞群，且巨噬细胞（CD11b^intF4/80^hi）数量显著增加。使用细胞作为参考对照即使结合多重AF提取，仍导致免疫细胞鉴定错误和巨噬细胞计数低估。因此，珠基参考对照与优化多重AF提取的组合最为稳健。

**2.2 脂肪变性肝脏（SL）与健康肝脏呈现不同的AF谱**

研究人员对db/db小鼠的脂肪变性肝脏（SL）进行AF谱鉴定，发现SL中4个AF谱（AF SL-1-4）中，AF SL-2-4与健康肝脏AF谱高度相似（SI>0.98），而AF SL-1为SL特有。这表明病理状态会改变AF组成。

**2.3 不完整AF提取导致无法区分巨噬细胞亚群**

逐步移除单个AF谱分析发现：移除共享谱AF Con-4/SL-4后，无法区分KC1（CD206^lo）和KC2（CD206^hi）两个库普弗细胞亚群。AF Con-4/SL-4特异地由KC1高表达，而其他AF谱（如Con-2）在所有KC中均有表达。不完整AF提取使得这些微小巨噬细胞亚群无法被区分。

**2.4 单独AF处理导致健康和MASH肝脏之间细胞计数的偏差**

对GAN饮食10周的小鼠（MASH组与对照组）进行分析，发现两者共有3个共享AF谱（AF H-1-3/AF M-1-3），以及各自2个独特谱。分别使用各自AF谱进行解混时，两组间CD45⁺细胞、总巨噬细胞和Ly6C^hi单核细胞计数存在显著差异。采用合并解混策略（包含3个共享谱及MASH独有的AF M-5）后，消除了异常细胞群并改善了分辨率。通过此策略，研究人员能正确定义MASH肝脏中的MdMs，包括moKCs和LAMs（以CD9⁺CD63⁺标记），突破了以往依赖阴性群的局限。

**2.5 AF谱在不同疾病阶段、性别和饮食模型间的变异性**

在GAN饮食模型中，10周与25周雄性小鼠相比，3个共享谱保留，且AF M-5为随时间保守谱。雄性（10周）与雌性（10周）相比，4个谱重叠，AF M-5亦保守。然而，GAN饮食与CDAA饮食模型相比，仅AF M-5一个谱共享，其余谱模型特异。表明AF谱包含保守成分和高度上下文依赖成分，要求不同模型间需细致表征AF。

**总结与讨论**

本研究表明，适当的多重自发荧光（AF）提取是光谱流式细胞术可靠鉴定和定量肝脏巨噬细胞的必要条件，尤其是在代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）这类高度AF的复杂组织中。不充分AF提取会导致巨噬细胞计数显著低估，并无法区分关键的库普弗细胞（KC）亚群（KC1/KC2）及单核细胞衍生巨噬细胞（MdMs）亚群。通过使用荧光珠参考对照、手动或自动化多重AF识别，并结合跨条件共享与条件特异AF谱的合并解混策略，研究人员实现了稳健的高维免疫表型分析，为理解MASH发病机制中巨噬细胞行为奠定了基础。研究还存在局限性：AF提取依赖手动操作易引入偏倚；不同解离方法、仪器和实验环境可能影响AF谱的可迁移性；膳食模型间AF差异可能部分源于时间和批次效应。未来需发展自动化标准化AF提取流程，并制定整合AF考虑的panel设计指南。

**研究结论部分翻译：** 在利用小鼠MASLD膳食模型的实验设置中，适当的AF提取是光谱流式细胞术可靠鉴定和定量肝脏巨噬细胞的关键，这可能与MASLD肝脏等组织的复杂性有关。当恰当处理时，光谱流式细胞术能够实现稳健的高维免疫谱分析，这对于理解健康和疾病状态下巨噬细胞的行为，以及推进靶向肝脏巨噬细胞亚群的治疗策略至关重要。