IGFBP4缺乏通过IGF1R/AKT通路对人前脂肪细胞增殖和分化的影响

《FEBS Open Bio》：Effects of IGFBP4 deficiency on human preadipocyte proliferation and differentiation through the IGF1R/AKT pathway

　　

脂肪生成涉及前脂肪细胞增殖和分化为成熟脂肪细胞，该过程的失调与代谢健康的变化相关。在此，研究人员旨在评估IGFBP4敲低（IGFBP4 KD）对人前脂肪细胞的影响，并确定这是否改变了IGF1信号传导。研究人员评估了不同人脂肪细胞模型中的增殖、成脂分化、基因表达以及IGF1受体（IGF1R）/AKT通路的激活。研究结果显示，IGFBP4 KD损害了增殖，并导致IGF1R和磷酸化AKT（Ser⁴⁷³）蛋白减少，尽管未观察到成脂分化的差异。此外，虽然添加重组人IGFBP4并未逆转这一效应，但蛋白质合成抑制在联合蛋白酶体抑制剂（而非溶酶体抑制剂）处理时消除了IGFBP4 KD介导的IGF1R下调。研究人员得出结论，IGFBP4敲低与IGF1R下调、AKT磷酸化受损和增殖抑制相关，表明IGFBP4是人前脂肪细胞中IGF1R稳态的关键调节因子。

**研究背景**
脂肪生成（adipogenesis）是间充质干细胞向脂肪细胞谱系定向、前脂肪细胞增殖并分化为成熟脂肪细胞的复杂过程，其调控失调与代谢健康改变密切相关。胰岛素样生长因子1（IGF1）是脂肪生成调控网络的核心，通过结合胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）激活下游PI3K/AKT通路，促进前脂肪细胞增殖和分化。胰岛素样生长因子结合蛋白4（IGFBP4）作为高亲和力结合蛋白，通常通过隔离IGF1抑制其与IGF1R结合，从而削弱下游信号。尽管IGFBP4在脂肪组织中表达，且动物研究提示其参与IGF1介导的脂肪组织扩张，但IGFBP4在人脂肪生成中的具体功能尚不明确，尤其是其对IGF1R/AKT通路的调控机制。为此，研究人员通过siRNA介导的IGFBP4敲低（IGFBP4 knockdown, KD）探究其对人前脂肪细胞增殖和分化的影响，并明确是否通过改变IGF1信号实现。

**研究内容与结论**
研究人员在三种人脂肪细胞模型（LipPD1、SGBS、原代SVF细胞）中实施IGFBP4 KD，发现该操作显著抑制前脂肪细胞增殖（细胞计数、Ki67标记、EdU掺入均显示下降），同时降低IGF1R及磷酸化AKT（Ser⁴⁷³）蛋白水平，但未对成脂分化（脂质积累、PPAR-γ表达）产生显著影响。添加重组人IGFBP4未能逆转IGF1R下调；而蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（cycloheximide, CHX）联合蛋白酶体抑制剂硼替佐米（bortezomib）可消除IGFBP4 KD介导的IGF1R降减，但溶酶体抑制剂氯喹（chloroquine）却无此效应。结论表明，IGFBP4 KD导致IGF1R下调、AKT磷酸化受损及增殖抑制，提示IGFBP4是人前脂肪细胞中IGF1R稳态的关键调节因子。该研究发表在《FEBS Open Bio》，为IGFBP4作为与IGF1R功能障碍相关的促有丝分裂及代谢紊乱的新治疗靶点提供了依据。

**关键技术方法**
研究使用了三种人前脂肪细胞模型：LipPD1细胞（来源于一名11月龄男性磷酸酶和张力蛋白同源物错构瘤肿瘤综合征（PHTS）患者的脂瘤组织）、SGBS细胞（来自Ulm大学M. Wabitsch教授馈赠）以及原代基质血管成分（SVF）细胞（从健康供者减重手术中切除的内脏或皮下脂肪组织分离，经莱比锡大学伦理委员会批准）。主要方法包括：电穿孔转染siRNA实现IGFBP4 KD（效率经qPCR和免疫印迹验证）；增殖检测通过细胞计数、Ki67免疫荧光染色、EdU掺入及IncuCyte活细胞成像；分化评估采用尼罗红（Nile Red）染色脂质积累；信号通路分析涉及Western blot检测IGF1R、磷酸化AKT（Ser⁴⁷³）及总AKT；此外，通过添加重组IGFBP4、重组IGF1，以及使用蛋白合成抑制剂CHX、蛋白酶体抑制剂硼替佐米、溶酶体抑制剂氯喹进行机制探究。

**研究结果**
**IGFBP4敲低损害细胞增殖**：通过细胞计数、Ki67染色及EdU掺入实验，IGFBP4 KD细胞在培养条件下增殖显著降低（约0.68倍对照），Ki67阳性率下降19.1%，DNA合成减少27%；活细胞成像显示IGFBP4 KD细胞在培养液、无血清培养基及添加IGF1的无血清培养基中汇合度均低于对照，且未检测到细胞衰老。

**IGFBP4敲低对脂肪细胞分化无显著影响**：在诱导分化9天后，IGFBP4 KD与对照细胞之间的脂质积累比例及成脂标志物PPAR-γ mRNA表达均无显著差异，尽管IGFBP4在早期分化细胞中表达最高。

**IGFBP4敲低导致IGF1R和磷酸化AKT下调**：Western blot显示，在未分化及分化早期（第3、5天）的IGFBP4 KD细胞中，IGF1R蛋白水平显著降低（P<0.05），磷酸化AKT（Ser⁴⁷³）亦下降；在无血清培养基中AKT磷酸化进一步减弱，IGF1刺激后虽能诱导AKT磷酸化，但IGFBP4 KD细胞中仍低于对照。基因表达分析表明，IGF1R、AKT2、INSR、IGF1 mRNA未受KD影响，但AKT1 mRNA下降（P<0.05）。在SGBS及原代SVF细胞中重复实验获得一致结果，验证了模型间的普适性。

**添加重组IGFBP4未能挽救IGF1R下调**：向IGFBP4 KD细胞补充重组IGFBP4（1 μg/mL）后，IGF1R蛋白和磷酸化AKT水平未恢复，而对照细胞中重组IGFBP4轻微增强了AKT磷酸化。添加重组IGF1同样降低了IGF1R蛋白（但诱导了AKT磷酸化），提示游离IGF1本身与IGF1R下调相关。

**抑制蛋白质合成抵消IGFBP4 KD介导的IGF1R下调**：使用CHX抑制蛋白从头合成后，IGFBP4 KD造成的IGF1R差异在DMSO对照和硼替佐米处理组中消失；而氯喹处理组中IGF1R仍下降（P=0.0067）。未加CHX时，IGFBP4 KD始终降低IGF1R蛋白，且硼替佐米可增强AKT磷酸化。结果提示IGF1R降解可能依赖新生蛋白，且涉及溶酶体途径。

**讨论与结论**
讨论部分指出，研究假设IGFBP4 KD通过释放IGF1激活IGF1R/AKT通路而促进增殖和分化，但实际发现与之相反：IGFBP4 KD抑制增殖并下调IGF1R及pAKT，分化未受影响，表明IGFBP4可能通过调节IGF1R稳态来调控人前脂肪细胞扩增。IGF1R下调解释了增殖抑制，这与其他研究中IGF1R缺失导致生长迟滞的报道一致。分化未受影响可能与IGFBP4 KD效率随时间降低、以及分化过程中胰岛素受体（INSR）主导信号有关。IGF1R蛋白下调后，添加重组IGFBP4未能逆转效应，可能与其生物活性或PAPP-A的切割作用有关。蛋白质合成抑制实验提示新生蛋白参与IGF1R降解，且溶酶体途径可能起关键作用（与LipPD1细胞的非肿瘤特性一致）。此外，IGFBP4还可能通过Wnt/β-catenin等IGF1非依赖性机制发挥作用，但尚需进一步研究。

**结论部分翻译**
总之，研究数据支持以下模型：IGF1——无论是由IGFBP4 KD释放还是外源添加——均诱导IGF1R下调。研究人员推测IGF1R蛋白表达可能依赖于IGFBP4和IGF1水平。当IGFBP4将IGF1维持在适当水平时，IGF1R运输允许持续的AKT信号传导；而IGFBP4 KD则与减弱的IGF1R信号相关。研究结果提示IGFBP4是与IGF1R功能障碍相关的促有丝分裂和代谢紊乱的潜在新治疗靶点。需要进一步研究阐明前脂肪细胞中IGF1R的循环机制，以及IGFBP4如何参与IGF1R内化、运输和AKT磷酸化过程。研究结果提示新生蛋白和溶酶体降解途径参与IGF1R下调。