PPARα激活通过抑制细胞焦亡缓解石胆酸诱导的肝损伤

《Liver Research》：PPARα activation alleviates lithocholic acid-induced liver injury by inhibiting pyroptosis

　　

背景与目的：胆汁淤积性肝损伤(Cholestatic Liver Injury, CLI)的发病机制尚不清楚，且缺乏有效治疗手段。过氧化物酶体增殖物激活受体α(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor α, PPARα)激动剂显示出潜在肝细胞保护作用，细胞焦亡(Pyroptosis)参与肝细胞损伤，但PPARα激活如何减轻石胆酸(Lithocholic Acid, LCA)诱导的细胞焦亡尚不明确。 方法：采用LCA诱导的小鼠肝内胆汁淤积模型评价PPARα激动剂的肝细胞保护作用。通过血清生化、苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin, H&E)及末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-Mediated dUTP Nick End Labeling, TUNEL)染色、电镜评估肝损伤。采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR)、蛋白质免疫印迹(Western Blot)及免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)分析细胞焦亡通路。 结果：形态学、组织病理学和生化分析证实PPARα激活对CLI具有保护作用。与单独LCA处理相比，PPARα激活显著减轻血清乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase, LDH)升高、TUNEL阳性细胞增多及肝细胞膜孔形成。机制上，PPARα激活抑制NOD样受体蛋白3(NOD-Like Receptor Protein 3, NLRP3)炎症小体介导的细胞焦亡及凋亡蛋白酶激活因子-1(Apoptosis Protease-Activating Factor-1, APAF-1)/半胱天冬酶-3(CASPASE-3)/Gasdermin E(GSDME)介导的细胞焦亡。此外，PPARα激动剂预处理抑制核因子κB(Nuclear Factor-Kappa B, NF-κB)和叉头框蛋白O1(Forkhead Box O1, FOXO1)信号通路激活。 结论：PPARα通过抑制NF-κB关联的NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡及FOXO1信号通路关联的APAF-1/CASPASE-3/GSDME介导的细胞焦亡，防护LCA诱导的CLI。

本文对发表于《Liver Research》的论文"PPARα activation alleviates lithocholic acid-induced liver injury by inhibiting pyroptosis"进行解读。

研究背景：胆汁淤积性肝损伤(Cholestatic Liver Injury, CLI)是多种肝胆疾病的共同病理基础，临床表现为胆汁排泄受阻，进而进展为炎症、纤维化及肝功能衰竭，其确切分子发病机制未明且缺乏有效疗法。细胞焦亡(Pyroptosis)是一种炎症小体驱动的程序性细胞死亡，其特征为细胞肿胀、质膜破裂及炎性介质释放；在梗阻性胆汁淤积患者及动物模型中均观察到肝细胞焦亡及NLRP3、cleaved Gasdermin D(GSDMD)上调，抑制焦亡具治疗潜力。过氧化物酶体增殖物激活受体α(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor α, PPARα)为配体激活转录因子，调控脂肪酸氧化、炎症及细胞命运，PPARα激动剂可调节胆汁酸合成与转运、减少肝内胆汁酸池、减轻CLI并具有抗炎效应，亦有研究表明PPARα激活可抑制NLRP3介导焦亡，但PPARα在胆汁淤积应激下调控肝细胞焦亡的具体分子机制尚未阐明。本研究旨在明确PPARα激活对LCA诱导小鼠CLI及肝细胞焦亡的影响并阐明其分子通路。

主要关键技术方法：研究人员采用8周龄雄性C57BL/6J小鼠建立LCA腹腔注射诱导的肝内胆汁淤积模型，设置对照组、PPARα激动剂非诺贝特(Fenofibrate, 200 mg/kg/day 灌胃)或WY-14643(50 mg/kg/day 腹腔注射)组、LCA(250 mg/kg/day)组及LCA+激动剂联合干预组(n=3–6)。检测血清ALT、AST、ALP、TBA、TBIL及LDH评估肝功能；肝组织行H&E及TUNEL染色、透射电镜观察超微结构；RT-qPCR检测焦亡及信号通路相关mRNA；Western Blot检测NLRP3、ASC、CASPASE-1 p20、GSDMD、N-GSDMD、APAF-1、CASPASE-3 p20、GSDME、N-GSDME、p-NF-κB p65(Ser536)、NF-κB、FOXO1、CDKN1A、CDKN1B、RBL2等蛋白；CASPASE-1活性试剂盒检测Caspase-1酶活性；Co-IP验证PPARα与NF-κB p65蛋白相互作用；在HepG2细胞中用环己酰亚胺(CHX)追踪实验及蛋白酶体抑制剂MG132、自噬抑制剂氯喹(CQ)分析FOXO1蛋白稳定性。

研究结果：

3.1. PPARα改善LCA诱导胆汁淤积模型中的肝损伤

研究人员发现LCA处理致小鼠胆囊增大、血清ALT、AST、总胆汁酸(Total Bile Acid, TBA)、总胆红素(Total Bilirubin, TBIL)显著升高，肝组织见广泛炎性浸润及融合性坏死；Fenofibrate或WY-14643预处理显著降低上述血清酶学及胆汁成分水平，减轻组织学损伤，证实PPARα激活减轻LCA诱导CLI。

3.2. PPARα抑制LCA诱导的肝细胞焦亡

透射电镜显示LCA组肝细胞周边见小凹坑及局灶质膜破裂，LCA显著升高肝组织LDH释放及TUNEL阳性细胞数，并上调Il-1β、Il-18 mRNA及成熟IL-1β、IL-18蛋白；Fenofibrate或WY-14643预处理逆转电镜下膜孔表型，显著降低LDH释放、TUNEL阳性细胞数及炎性因子成熟形式，证实PPARα激活抑制LCA诱导的肝细胞焦亡及伴随炎症反应。

3.3. PPARα通过NLRP3/CASPASE-1/GSDMD通路改善LCA诱导焦亡

LCA显著升高肝组织CASPASE-1活性，上调Nlrp3、Pycard、Gsdmd mRNA及NLRP3、ASC、CASPASE-1、CASPASE-1 p20、总GSDMD和N端GSDMD(N-GSDMD)蛋白；Fenofibrate或WY-14643预处理下调CASPASE-1活性、相关mRNA及NLRP3炎症小体组分与GSDMD剪切，表明PPARα激活通过抑制NLRP3/CASPASE-1/GSDMD轴减轻LCA诱导焦亡。

3.4. PPARα通过APAF-1/CASPASE-3/GSDME通路改善LCA诱导焦亡

LCA诱导APAF-1、CASPASE-11、CASPASE-3、GSDME及其活化片段(CASPASE-11 p20、CASPASE-3 p20、N-GSDME)的mRNA和蛋白水平升高；Fenofibrate或WY-14643预处理显著逆转上述变化，提示PPARα激活抑制APAF-1/CASPASE-3/GSDME介导的焦亡通路。

3.5. PPARα减弱LCA诱导损伤中NF-κB信号活化

LCA上调肝组织TnF-α、Il-6、Icam-1、Cox-2、Mcp-1、iNos mRNA及磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65 Ser536)、总NF-κB、IL-6蛋白；Fenofibrate或WY-14643预处理降低上述炎性因子转录及NF-κB活化。Co-IP证实PPARα与NF-κB p65存在直接蛋白互作，提示PPARα可能 sequestrate NF-κB阻止其转录激活，从而抑制NF-κB/NLRP3轴。

3.6. PPARα抑制LCA诱导损伤中FOXO1信号活化

LCA上调Foxo1、Cdkn1a、Cdkn1b、Rbl2 mRNA及FOXO1、CDKN1A、CDKN1B、RBL2蛋白，并促进FOXO1核转位；Fenofibrate或WY-14643预处理降低FOXO1表达并阻断其核转位。在HepG2细胞中，PPARα过表达加速CHX作用下FOXO1蛋白降解，MG132或CQ可恢复FOXO1蛋白量，表明PPARα促进蛋白酶体介导的FOXO1降解，通过抑制FOXO1/APAF-1轴减轻焦亡。

讨论与结论总结：

临床中原发性胆汁性胆管炎(Primary Biliary Cholangitis, PBC)患者肝组织PPARα表达降低，CLI中焦亡相关蛋白升高，抑制焦亡可限制肝损伤。本研究表明PPARα激动剂Fenofibrate或WY-14643通过抑制NLRP3炎症小体及APAF-1焦尸小体(pyroptosome)，减轻LCA诱导肝损伤与焦亡，机制分别涉及抑制NF-κB/NLRP3轴和FOXO1/APAF-1/CASPASE-3/GSDME轴；Co-IP证实PPARα与NF-κB p65互作，细胞实验提示PPARα促进FOXO1泛素-蛋白酶体降解。作者指出局限在于尚需Nlrp3或Apaf-1基因敲除鼠验证及进一步明确NF-κB、FOXO1具体调控机制。

结论原文翻译：

综上所述，本研究结果表明，PPARα激活通过抑制与NF-κB相关的NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡及与FOXO1信号通路相关的APAF-1/CASPASE-3/GSDME介导的细胞焦亡，保护肝脏免受LCA诱导的CLI。这些数据支持PPARα作为CLI有前景的治疗靶点，并为后续临床应用研究奠定基础。