载脂蛋白A2对脂质代谢和动脉粥样硬化形成的背景依赖性效应

《The FASEB Journal》：Context-Dependent Effects of Apolipoprotein A2 on Lipid Metabolism and Atherogenesis

　　

载脂蛋白A2（APOA2）是多种血浆脂蛋白的组成成分，但其生理和病理功能仍不明确。关于其对血浆脂质水平和心血管风险影响的相互矛盾的数据表明，APOA2的活性可能具有背景依赖性。在此，研究人员采用腺病毒介导的人APOA2基因转移，将其导入雄性C57BL/6、ldlr^?/?和apoe^?/?小鼠，这些小鼠喂食西方饮食2周，以平行研究APOA2在不同血脂异常和动脉粥样硬化负荷条件下对脂蛋白代谢和动脉粥样硬化形成的影响。在血脂正常的C57BL/6小鼠中，APOA2表达升高了血浆极低密度脂蛋白（VLDL）/低密度脂蛋白（LDL）胆固醇和甘油三酯水平，这与脂蛋白脂肪酶（LpL）活性的抑制一致。在高密度脂蛋白（HDL）密度组分中，胆固醇未受影响，而甘油三酯增加。相反，在ldlr^?/?小鼠中，APOA2表达降低了所有主要脂蛋白组分（包括HDL密度组分）的胆固醇和甘油三酯水平。类似地，在apoe^{?/?小鼠中，APOA2表达显著降低了VLDL胆固醇和甘油三酯，但LDL和HDL密度组分中的胆固醇和甘油三酯却增加。有趣的是，在给ldlr?/?小鼠口服含有[14C]-胆固醇和[3H]-三油酸甘油酯的橄榄油后，APOA2表达增强了示踪剂在主动脉和主动脉根部的沉积。与这一发现相印证，对ldlr?/?和apoe?/?小鼠主动脉根部冰冻切片的免疫组化分析显示，表达APOA2的动物中APOA2和载脂蛋白B（APOB）染色增强，表明含APOB的脂蛋白在动脉壁中积聚增加。总体而言，这些发现支持APOA2的促动脉粥样硬化作用。虽然在血脂异常条件下APOA2通过降低循环中含APOB的脂蛋白可能表面上看起来具有保护作用，但机制证据表明，它促进了含APOB颗粒在血管内的滞留，从而加速了动脉粥样硬化形成。}

**研究背景与问题**
载脂蛋白A2（APOA2）是血浆脂蛋白的组成成分，主要存在于高密度脂蛋白（HDL）中，也存在于含载脂蛋白B（APOB）的脂蛋白中。既往研究表明APOA2影响HDL颗粒的生成和功能，并可改变HDL亚群大小、分布及其载脂蛋白A1（APOA1）含量。然而，关于APOA2在脂蛋白代谢和冠状动脉疾病中的作用存在相互矛盾的证据：部分研究提示APOA2促进动脉粥样硬化，另一些则提示其与逆向胆固醇转运正相关、与非钙化斑块负荷负相关。此外，早期转基因研究多采用超生理水平的人APOA2表达，生理水平APOA2在不同血脂异常状态下的作用尚不清楚，特别是含APOB脂蛋白与动脉脂质沉积之间的关系仍不明确。因此，研究人员开展本研究，旨在探讨生理相关水平APOA2表达对不同遗传背景小鼠脂蛋白代谢、组织脂质分布及动脉粥样硬化形成的影响。

**研究内容与结论**
研究人员通过腺病毒介导的人APOA2基因转移至C57BL/6、ldlr<sup>?/?和apoe?/?小鼠（均为雄性，约28周龄，购自Jackson Laboratory），喂食西方高脂饮食2周，平行检测APOA2在不同血脂异常和动脉粥样硬化负荷下的作用。结果表明：APOA2在血脂正常小鼠中升高VLDL/LDL胆固醇和甘油三酯（抑制LpL活性），而在ldlr?/?小鼠中降低所有脂蛋白组分的脂质，在apoe?/?小鼠中则降低VLDL脂质但升高LDL和HDL脂质。通过口服[14C]-胆固醇和[3H]-三油酸甘油酯示踪，发现APOA2表达促进放射性标记物在主动脉和主动脉根部的沉积。免疫组化显示APOA2和APOB在动脉粥样硬化斑块中共定位增加。结论：APOA2是一种促动脉粥样硬化因子，它通过促进含APOB颗粒在血管壁滞留而非降低循环脂质发挥作用。该论文发表在《The FASEB Journal》。

**主要关键技术与方法**
1. 腺病毒（Adenovirus）介导的基因转移：将表达人APOA2（AdAPOA2）或绿色荧光蛋白（AdGFP）的重组腺病毒经尾静脉注射至小鼠体内（剂量6×109 pfu/只），实现生理水平APOA2表达（约9.58–15.4 mg/dL）。
2. 脂蛋白密度梯度KBr超速离心（UCF）：分离血浆为VLDL、IDL/LDL、HDL及脂蛋白缺陷组分，分析各组分脂质和载脂蛋白分布。
3. 口服脂肪负荷与放射性示踪：给ldlr?/?小鼠灌胃含[3H]-三油酸甘油酯和[14C]-胆固醇的橄榄油，监测血浆放射性240 min，并测量肝脏、主动脉和主动脉根部的放射性沉积。
4. 免疫组化与Oil Red O染色：对主动脉根部冰冻切片进行APOA2和APOB免疫荧光染色及脂质染色，使用QuPath软件定量荧光强度。
5. 实时定量PCR（qPCR）：检测肝脏中hAPOA2、内源apoa2、apoa1、apob和apoe mRNA表达。

**研究结果**
**3.1 APOA2表达改变C57BL/6、ldlr?/?和apoe?/?小鼠的血浆脂质水平和脂蛋白分布**
通过脂蛋白密度梯度超速离心和Western blot分析，在C57BL/6小鼠中，APOA2表达升高总胆固醇和甘油三酯，主要是LDL胆固醇增加及所有脂蛋白组分甘油三酯升高；在ldlr?/?小鼠中，APOA2显著降低VLDL、LDL和HDL的胆固醇和甘油三酯；在apoe?/?小鼠中，APOA2降低VLDL胆固醇和甘油三酯，但升高LDL和HDL的胆固醇和甘油三酯。APOA2主要分布于HDL，在C57BL/6小鼠中也见于非HDL组分。qPCR证实人APOA2表达不改变内源载脂蛋白基因表达。

**3.2 APOA2表达损伤血脂异常小鼠的餐后甘油三酯清除，但不影响野生型C57BL/6**
口服橄榄油后，C57BL/6小鼠的餐后甘油三酯曲线和曲线下面积（AUC）无变化；ldlr?/?小鼠APOA2组餐后甘油三酯持续升高，AUC显著增加；apoe?/?小鼠APOA2组也有轻度的餐后甘油三酯清除延迟及AUC增加。

**3.3 APOA2表达增加apoe?/?小鼠的肝脏VLDL-甘油三酯分泌，但不影响ldlr?/?和C57BL/6**
使用Triton WR1339抑制LpL后测量肝脏VLDL-甘油三酯分泌率，C57BL/6和ldlr?/?小鼠中两组无差异；apoe?/?小鼠APOA2组的VLDL-甘油三酯分泌率比对照组升高38.5%。

**3.4 APOA2表达增加apoe?/?小鼠的总甘油三酯输入和肠乳糜微粒分泌，但不影响ldlr?/?和C57BL/6**
通过口服橄榄油后注射Triton WR1339测量总甘油三酯输入，减去肝脏分泌后计算肠乳糜微粒分泌。C57BL/6和ldlr?/?小鼠无变化；apoe?/?小鼠APOA2组的肠乳糜微粒分泌率较对照组升高448%。

**3.5 口服放射性标记脂质负荷揭示APOA2表达增强ldlr?/?小鼠的组织脂质沉积**
ldlr?/?小鼠喂食高脂饮食12周诱导动脉粥样硬化后，灌胃含有[3H]-三油酸甘油酯和[14C]-胆固醇的橄榄油。血浆放射性曲线两组无差异；但APOA2组在主动脉和主动脉根部的[3H]和[14C]放射性显著高于对照组，肝脏中[3H]也有轻度升高而[14C]无变化。

**3.6 APOA2表达促进ldlr?/?和apoe?/?小鼠动脉粥样硬化斑块中含APOB颗粒的沉积**
对ldlr?/?和apoe?/?小鼠主动脉根部冰冻切片进行免疫组化，APOA2和APOB荧光强度在AdAPOA2感染组均显著高于对照组。Oil Red O染色证实两组均有脂质丰富斑块，但APOA2组APOB含量更高。

**讨论与结论**
该研究证实APOA2对脂蛋白代谢的影响强烈依赖于血脂异常背景。在正常血脂小鼠中，APOA2抑制LpL活性，升高VLDL/LDL脂质；而在血脂异常小鼠中，APOA2降低VLDL但可能通过非LDLR途径促进VLDL向LDL转化，导致LDL在血管壁沉积增加。放射性示踪和免疫组化结果共同支持APOA2促进含APOB脂蛋白在主动脉滞留，加速动脉粥样硬化形成。尽管APOA2在血脂异常小鼠中降低了循环含APOB脂蛋白水平（表面上看似有益），但机制分析显示其实际作用是增强血管沉积，因此是“伪装的坏人”。研究局限性包括仅雄性小鼠及仅在ldlr?/?中进行放射性示踪实验。结论部分原文翻译如下：我们的数据强化了APOA2显著的促动脉粥样硬化作用。本研究提供了关于人APOA2对脂蛋白代谢和动脉粥样硬化形成多方面影响的新见解，突出了其背景特异性功能。通过将腺病毒介导的基因转移到C57BL/6、ldlr?/?和apoe?/?小鼠模型，研究人员提供了证据表明APOA2是载脂蛋白中隐藏的恶棍：尽管生理水平的人APOA2表达在血脂异常小鼠中以乍看有益的方式改变脂质和脂蛋白谱（例如降低循环中含APOB的脂蛋白），但仔细的机制分析揭示了明确的促动脉粥样硬化作用——APOA2驱动含APOB颗粒沉积到血管系统，从而加速动脉粥样硬化形成。虽然研究人员未直接检查血管细胞特异性信号通路，但当前数据表明APOA2表达在动脉沉积水平改变了循环脂质的命运。这些发现提示APOA2可能调节脂蛋白-动脉壁相互作用、滞留或跨内皮运输，这些机制值得进一步研究。虽然研究人员未评估介导APOA2增强含APOB脂蛋白在动脉壁沉积的细胞机制，但承认糖胺聚糖在此过程中的潜在贡献，并将其视为未来研究有价值的方向。从治疗角度，当前发现提示靶向APOA2表达或其与富含甘油三酯脂蛋白的相互作用可能作为一种替代策略减少血管脂质沉积，特别是在传统降脂方法未能完全降低心血管风险的背景下。</sup>