桐素(Tectochrysin)通过激活肠上皮细胞线粒体自噬(Mitophagy)改善小鼠结肠炎相关性结肠癌(Colitis-Associated Colon Cancer, CAC)

《Molecular Nutrition & Food Research》：Tectochrysin Ameliorates Colitis-Associated Colon Cancer in Mice Via the Activation of Mitophagy in Intestinal Epithelial Cells

　　

摘要：桐素(Tectochrysin, TEC)是一种天然黄酮类化合物，已被证实可改善慢性结肠炎，但其对结肠炎相关性结肠癌(Colitis-Associated Colon Cancer, CAC)的治疗潜力尚不清楚。本研究旨在探讨TEC对偶氮甲烷(Azoxymethane, AOM)/葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium, DSS)诱导的小鼠CAC模型的干预效应，并阐明其分子机制。研究人员建立AOM/DSS诱导的CAC小鼠模型，给予TEC和/或Drp1抑制剂Mdivi-1干预，采用蛋白质免疫印迹(Western blot)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、透射电子显微镜(TEM)、免疫荧光(Immunofluorescence)及荧光素酶报告基因 assay 检测线粒体自噬(Mitophagy)活化及相关信号通路。结果显示，TEC显著减轻CAC进展，表现为肿瘤负荷降低、疾病活动指数(Disease Activity Index, DAI)下降及体重丢失减少；TEC通过Pink1/Parkin通路激活肠上皮细胞(Intestinal Epithelial Cells, IECs)中线粒体自噬，并可逆转Mdivi-1引起的线粒体自噬抑制。综上所述，桐素通过激活肠上皮细胞线粒体自噬改善CAC，提示其可作为CAC的潜在治疗药物。

论文解读：Tectochrysin通过激活肠上皮细胞Pink1/Parkin介导的线粒体自噬改善小鼠结肠炎相关性结肠癌

研究背景与立项依据

天然黄酮类化合物因抗炎及抗肿瘤活性受到广泛关注。桐素(Tectochrysin, TEC)是其中之一，前期研究发现其可通过调节肠道菌群、抑制炎症及增强肠道屏障功能改善DSS诱导的慢性结肠炎。复发性慢性结肠炎可导致肠上皮异型增生并进展为结肠炎相关性结肠癌(Colitis-Associated Colon Cancer, CAC)，约占所有结肠癌的20%，目前临床干预手段有限，亟需开发新治疗策略。线粒体自噬(Mitophagy)在维持细胞稳态及抑制肿瘤发生中起关键作用，部分黄酮类化合物可通过Pink1/Parkin通路诱导线粒体自噬，但其在肠上皮细胞(Intestinal Epithelial Cells, IECs)中的具体机制尚不明确。转录因子Foxo3a可结合Pink1启动子区促进受损线粒体清除，然而Pink1/Parkin通路在生理及病理状态下体内功能验证仍不足。因此，研究人员假设TEC可通过上调Foxo3a激活Pink1/Parkin通路介导的线粒体自噬，从而抑制CAC发生发展，并开展本研究验证该假说。

主要关键技术方法

研究人员采用AOM/DSS经典方案建立CAC小鼠模型（SPF级雄性C57BL/6J小鼠，随机分为对照组、TEC组、AOM/DSS模型组、AOM/DSS+TEC组、AOM/DSS+Mdivi-1+阴性对照饮食组、AOM/DSS+Mdivi-1+TEC组，n=8），TEC以0.5%(w/w)掺入饲料干预，Mdivi-1按10 mg/kg腹腔注射；体外采用人结肠上皮细胞系NCM460，经Mdivi-1预抑制后给予20 μM TEC处理。检测手段包括：Western blot及qRT-PCR检测Pink1、Parkin、Foxo3a、p62、Tomm20、Drp1、LC3-II、Ki-67、cleaved Caspase-3蛋白及mRNA水平；透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy, TEM)观察线粒体超微结构及线粒体自噬体；免疫荧光染色检测线粒体活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)；双荧光素酶报告基因检测Foxo3a对Pink1启动子的转录激活作用；染色质免疫沉淀-定量PCR(Chromatin Immunoprecipitation qPCR, ChIP-qPCR)验证Foxo3a与Pink1启动子结合；免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)检测Ki-67及cleaved Caspase-3；氯喹(Chloroquine, CQ)阻断实验评估自噬流(Autophagic Flux)。

研究结果

3.1 Tectochrysin Ameliorates Disease Severity and Tumorigenesis in AOM/DSS-Induced CAC Mice

研究人员通过大体标本观察、肿瘤计数、体重监测及疾病活动指数(DAI)评分发现，TEC干预显著降低AOM/DSS小鼠结肠肿瘤数目、DAI评分，减轻体重下降；H&E染色显示肠上皮结构改善，IHC示Ki-67阳性细胞减少、cleaved Caspase-3阳性细胞增多。结论：TEC在体内有效抑制CAC进展。

3.2 Tectochrysin Activates the Pink1/Parkin Pathway and Restores Mitophagy in Colonic Epithelial Cells

Western blot及qRT-PCR显示AOM/DSS小鼠结肠组织Pink1、Parkin蛋白及mRNA下调，TEC可逆转此下调；同时TEC上调p62、Tomm20、Drp1表达。TEM观察到AOM/DSS组线粒体肿胀、嵴破坏，TEC组见完整线粒体及被自噬体包裹的线粒体（线粒体自噬体）。结论：TEC激活Pink1/Parkin通路并促进肠上皮细胞线粒体自噬。

3.3 Tectochrysin Rescues Mdivi-1-Impaired Mitophagy in Intestinal Epithelial Cells In Vitro

NCM460细胞中，Mdivi-1抑制PINK1、Parkin、p62、TOMM20、DRP1表达并致ROS蓄积及线粒体损伤，TEC共处理可逆转上述分子变化、降低ROS、保护线粒体形态。CQ阻断实验显示TEC+CQ组LC3-II蓄积多于单用CQ且p62略降，证实TEC促进自噬流。结论：TEC直接在体外激活Pink1/Parkin通路并促进自噬流，拮抗药物性线粒体自噬抑制。

3.4 Tectochrysin Counteracts the Tumor-Promoting Effect of Mdivi-1 in CAC Mice

体内给予Mdivi-1加剧AOM/DSS小鼠肿瘤负荷、体重丢失及DAI升高，同期给予TEC可显著减轻上述恶化表型，降低Ki-67、升高cleaved Caspase-3。结论：TEC介导的线粒体自噬激活足以在体拮抗线粒体自噬抑制带来的促瘤效应。

3.5 Tectochrysin Restores Mitophagy in the Colonic Epithelium of CAC Mice Treated With Mdivi-1

对Mdivi-1干预小鼠结肠组织检测发现，TEC共给药可恢复被Mdivi-1抑制的Pink1、Parkin、p62、Tomm20、Drp1表达（蛋白及mRNA水平），TEM见线粒体超微结构改善。结论：TEC通过解除Mdivi-1对Pink1/Parkin介导线粒体自噬的抑制发挥保护作用。

3.6 The Transcription Factor FOXO3a Mediates the Upregulation of PINK1 by Tectochrysin

shRNA敲低FOXO3A后，PINK1、Parkin基础表达降低，且TEC无法再上调FOXO3A、PINK1及Parkin；生物信息学预测Pink1启动子含FOXO3A结合基序(ATGAGTCA)，双荧光素酶报告基因显示FOXO3A过表达增强Pink1启动子活性，ChIP-qPCR直接证实FOXO3A结合Pink1启动子区。结论：TEC上调转录因子FOXO3A，后者结合并激活Pink1转录，进而启动Pink1/Parkin通路依赖的线粒体自噬。

讨论与结论总结

讨论部分指出，本研究首次证明TEC可减轻AOM/DSS诱导的小鼠CAC，机制为TEC上调FOXO3A，促进其结合Pink1启动子驱动转录，激活Pink1/Parkin通路介导的肠上皮细胞线粒体自噬，恢复线粒体稳态并抑制肿瘤发生。研究使用Mdivi-1（Drp1抑制剂）作为药理学线粒体分裂/线粒体自噬干扰工具，虽非特异性线粒体自噬抑制剂，但TEC可部分逆转其效应；FOXO3A在体外被证实为贡献性而非唯一上游调控因子。局限性包括未行肠上皮特异性Pink1或Foxo3a基因敲除验证因果、TEC人体等效剂量及药代动力学尚未明确、体外浓度(20 μM)与人可达成血药浓度关系待考。作者认为TEC除激活线粒体自噬外可能兼具抗炎抗氧化多效性，未来需进一步分离各通路贡献。

研究结论（翻译）：总之，本研究表明桐素(Tectochrysin)通过Foxo3a/Pink1/Parkin轴激活肠上皮细胞线粒体自噬，从而改善小鼠结肠炎相关性结肠癌，不仅加深了对黄酮类化合物抗肿瘤机制的理解，也为CAC防治提供了候选药物及靶点依据。