《The FASEB Journal》：Retinoic Acid Informs the Positional Identity of Frontonasal Neural Crest Cells Through Alx Family of Transcription Factors
编辑推荐：
颅神经嵴细胞（CNCCs）构成了面部大部分骨骼元件。面部的精确形态发生依赖于高度协调的CNCCs行为，要求每个CNCC获得正确的位置身份。作为一种扩散性信号分子，视黄酸（RA）已知通过激活Hox转录因子家族来调控发育中后脑前后轴的位置身份。然而，RA是否也直接
颅神经嵴细胞（CNCCs）构成了面部大部分骨骼元件。面部的精确形态发生依赖于高度协调的CNCCs行为，要求每个CNCC获得正确的位置身份。作为一种扩散性信号分子，视黄酸（RA）已知通过激活Hox转录因子家族来调控发育中后脑前后轴的位置身份。然而，RA是否也直接调控Hox阴性CNCCs（Hox-negative CNCCs）的位置身份尚不清楚，这些细胞构成面部的骨架结构。在本研究中，研究人员展示了RA作为局部环境信号，通过激活Alx转录因子家族来模式化Hox阴性CNCCs。研究人员观察到在通过反向的泛RAR拮抗剂（inverse pan-RAR agonist）阻断RA信号的鸡胚中，出现了中面部发育不全和中线面部裂隙。基因表达分析揭示，这种形态缺陷与额鼻神经嵴身份向第一咽弓（PA1）样身份的转化相关，这种模式缺陷同样出现在Alx1和Alx4复合突变小鼠胚胎中。研究人员进一步表明，Alx1和Alx4均通过细胞自主的RA受体（RAR）信号受RA调控。机制上，RA信号通过位于Alx1上游Lrriq1基因内含子区域内一个进化保守的远端增强子调控Alx1，而Alx4的RA响应性由其启动子赋予。这些发现建立了RA信号与Alx基因之间的机制联系，并为RA信号中断相关的颅面缺陷提供了新见解。
**论文解读：视黄酸通过Alx转录因子调控额鼻神经嵴细胞位置身份**
**研究背景与问题**
颅神经嵴细胞（CNCCs）是面部骨骼的主要来源，其精确的位置身份对正常面部形态发生至关重要。已知视黄酸（RA）通过Hox转录因子调控后脑前后轴的位置，但RA是否直接调控面部Hox阴性CNCCs的位置身份尚不清楚。Alx转录因子家族（Alx1、Alx3、Alx4）在中面部发育中起关键作用，其突变导致人类额鼻发育不良（FND），但RA与Alx基因之间的调控关系未被阐明。本研究旨在探究RA信号如何通过Alx基因决定CNCCs的额鼻身份，并揭示其机制。论文发表在《The FASEB Journal》。
**关键技术与方法**
研究人员使用鸡胚模型，通过植入BMS493（泛RAR反向激动剂）阻断RA信号，并采用全原位杂交、杂交链式反应（HCR）、面部外植体培养、鸡胚电穿孔和荧光素酶报告基因实验。还分析了公共ATAC-seq、RARαa ChIP-seq和PCHi-C数据，进行跨物种基因组比对和增强子鉴定。
**研究结果**
**3.1 阻断RA信号导致中线面部裂隙和前颌骨发育不全**
通过将BMS493浸泡的珠子植入HH9-10鸡胚前脑，发现75.8%的胚胎出现中面部缺陷，包括前鼻肿块（FNM）发育不全、中线裂隙和异常结节。7天后，80%的胚胎出现上喙中线裂隙、鼻孔塌陷和卵齿缺失；组织学显示鼻中隔及前鼻软骨异常，前颌骨严重发育不良。
**3.2 阻断RA信号导致额鼻神经嵴细胞模式缺陷**
BMS493处理2天后，额鼻神经嵴细胞中检测到异位表达咽弓标记基因Dlx1和Dlx2（86.4%），同时额鼻标记基因Alx1/4表达降低。4天后，FNM中CNCCs来源的间充质细胞持续出现异位Dlx1/2和Lhx8表达，伴随Alx1/4丧失，表明CNCCs获得了第一咽弓（PA1）样身份而非额鼻身份，这可能是导致前颌骨缺陷和裂隙的原因。
**3.3 RA调控中面部发育中Alx1和Alx4的表达**
通过全原位杂交，发现Alx1和Alx4在额鼻区和眼周区域动态表达，RA合成酶Aldh1a1/3在视网膜和鼻基板表达。BMS493处理2天后，Alx1和Alx4表达显著降低（92.9%）。在面部外植体培养中加入全反式RA（atRA）后，Alx1/4在额鼻区表达显著增加，但在咽弓中仅部分样本出现异位表达。
**3.4 RAR信号在CNCCs中通过Alx基因发挥细胞自主作用**
通过电穿孔将显性负性RARα（RAR403）转入HH8鸡胚神经管，在额鼻突（FNP）中，RAR403转染的CNCCs特异性丧失Alx1和Alx4表达，并异位表达PA1标记Dlx2，而周围非转染细胞正常。共转染鸡Alx1表达载体可抑制RAR403诱导的Dlx1/2异位表达，但不能恢复Alx4表达，表明Alx基因是RA信号的关键下游效应器。
**3.5 Alx1和Alx4可能是额鼻神经嵴中RA信号的直接下游靶点**
通过将斑马鱼RARαa ChIP-seq数据映射到小鼠基因组，结合ATAC-seq和PCHi-C数据，鉴定出Alx1远端增强子（Alx1-DE1）和Alx4启动子为候选RA响应顺式调控元件。荧光素酶实验显示，在RA处理下，Alx1-DE1和Alx4启动子活性显著增强。Alx1-DE1含有进化保守的DR5型RARE，并与Alx1启动子发生长程相互作用；Alx4启动子中鉴定出非经典RARE（IR9和DR6）。
**总结与讨论**
研究结论：RA信号作为局部环境信号，通过细胞自主的RAR信号激活Alx1和Alx4的表达，从而赋予额鼻神经嵴细胞正确的额鼻身份，并抑制PA1样身份的建立。RA通过进化保守的增强子Alx1-DE1调控Alx1，通过启动子调控Alx4。这些发现为RA信号中断相关的颅面缺陷提供了机制解释，并可能提示Alx基因参与胎儿酒精谱系障碍（FASD）的颅面表型。讨论部分指出，虽然RA对Alx1/4的表达必不可少，但可能不足以维持其稳健表达，BMP信号等其他通路也可能参与调控；未来的研究需在哺乳动物CNCCs中验证RAR结合位点。结论段落翻译：这些发现建立了RA信号和Alx基因之间的机制联系，并为与RA信号中断相关的颅面缺陷提供了新见解。
