NPY1R/CREB信号轴调控衰老卵巢颗粒细胞炎症反应及卵巢衰老的机制与干预

《The FASEB Journal》：Mechanism and Intervention of the NPY1R/CREB Signaling Axis in Regulating Inflammatory Response in Aged Ovarian Granulosa Cells and Ovarian Senescence

　　

卵巢衰老伴随炎症反应，但其潜在机制尚未完全阐明。在本研究中，研究人员对高龄患者和正常（Ctrl）患者的卵巢颗粒细胞进行了转录组测序，发现神经肽Y Y1受体（NPY1R）在衰老颗粒细胞中显著上调。体内实验证实，NPY1R激动剂[Leu³¹, Pro³⁴]-NPY诱导了小鼠发情周期紊乱，抑制了卵泡发育，引发了卵母细胞中活性氧（ROS）积累和线粒体结构损伤，从而诱导铁死亡（ferroptosis），最终导致卵巢功能障碍和卵母细胞质量下降；相反，NPY1R拮抗剂BIBO 3304则有效逆转了这些表型。机制研究表明，NPY1R过表达激活了p-CREB信号通路，促进了促炎因子IL-6和炎症小体NLRP3的表达，加剧了铁死亡、线粒体功能障碍以及I/III型胶原失衡，最终加速了卵巢衰老。总之，本研究阐明了NPY1R/CREB信号轴通过调控炎症反应参与卵巢衰老，并揭示了其在卵泡发育和氧化应激中的关键作用。靶向NPY1R有望成为改善高龄女性卵巢功能和不孕症的一种潜在治疗策略。

**论文解读：NPY1R/CREB信号轴在衰老卵巢颗粒细胞炎症反应及卵巢衰老中的机制与干预**

**研究背景与问题**
女性卵巢衰老是伴随年龄增长的渐进性生理过程，主要表现为卵泡储备耗竭、卵母细胞质量下降、促炎因子水平升高、胶原沉积增加、氧化应激增强及线粒体功能障碍。颗粒细胞作为卵泡发育的核心支持细胞，其功能障碍被认为是卵母细胞质量受损的关键始动因素。在衰老状态下，颗粒细胞过度分泌促炎因子（如IL-6、NLRP3等），形成慢性低度炎症微环境，进一步加剧氧化应激和组织纤维化。然而，调控衰老颗粒细胞炎症反应的上游分子机制尚不完全清楚。神经肽Y（NPY）及其受体Y1（NPY1R）作为G蛋白偶联受体（GPCR）家族成员，已知参与能量代谢、应激反应和免疫调节，但在卵巢衰老中的作用仍属空白。研究人员旨在探究NPY1R是否通过cAMP-CREB信号通路调节衰老颗粒细胞的炎症反应，从而影响卵巢功能，并评估靶向NPY1R的治疗潜力。

**研究开展与结论**
本研究收集正常卵巢功能患者（对照组，年龄<35岁）和高龄患者（年龄>38岁）的卵巢颗粒细胞进行转录组测序，发现NPY1R在衰老颗粒细胞中显著上调。通过体外原代细胞培养和体内小鼠模型（2月龄年轻CD-1雌鼠和12月龄衰老CD-1雌鼠），分别使用NPY1R选择性激动剂[Leu³¹, Pro³⁴]-NPY和拮抗剂BIBO 3304进行干预，系统评估了NPY1R对卵巢功能和卵母细胞质量的影响。研究证实：NPY1R过表达通过激活CREB磷酸化（p-CREB）信号，促进促炎因子IL-6和炎症小体NLRP3的表达，诱发铁死亡、线粒体功能障碍及I/III型胶原比例失衡，最终加速卵巢衰老；而NPY1R拮抗剂BIBO 3304能有效逆转上述表型，改善发情周期，增加卵泡数量，降低ROS和Fe²⁺水平，恢复线粒体膜电位，减轻组织纤维化。该论文发表于《The FASEB Journal》。

**关键技术与方法**
研究人员从郑州大学第一附属医院招募100例辅助生殖患者（对照组50例，高龄组50例），收集卵泡液分离纯化人原代颗粒细胞。采用转录组测序（RNA-seq）鉴定差异表达基因，并用qPCR和Western blot验证NPY1R及下游信号通路蛋白。体内实验使用CD-1小鼠（2月龄和12月龄），通过饲料添加激动剂或拮抗剂进行8周干预。主要技术包括：发情周期阴道涂片HE染色、卵巢组织HE染色和卵泡计数、超促排卵后卵母细胞计数、透射电镜（TEM）观察线粒体超微结构、JC-1探针检测线粒体膜电位（MMP）、ROS和Fe²⁺荧光染色、免疫荧光（IF）定位p-CREB、IL-6、NLRP3、Western blot、天狼星红（PSR）偏振光染色评估胶原纤维类型、siRNA基因敲低和腺病毒过表达、CCK-8细胞活力检测。

**研究结果**

**3.1 NPY1R在衰老卵巢颗粒细胞中上调并与衰老通路高度相关**
通过RNA-seq比较高龄与正常患者颗粒细胞转录组，鉴定出1704个差异表达基因（DEGs），其中NPY1R显著上调（3.15倍）。KEGG富集分析显示DEGs显著富集于cAMP信号通路。qPCR验证进一步确认NPY1R mRNA在衰老颗粒细胞中升高，提示NPY1R作为cAMP通路上游调控因子可能参与卵巢衰老。

**3.2 NPY1R激动剂诱导年轻小鼠卵巢功能与卵母细胞质量下降**
对8周龄年轻小鼠饲喂[Leu³¹, Pro³⁴]-NPY 8周后，发情周期显著延长（6-10天 vs. 对照4-5天），各级卵泡数量减少，超排后卵母细胞数降低。TEM显示卵母细胞线粒体肿胀、嵴断裂，Fe²⁺和ROS水平升高，JC-1红/绿比下降（膜电位降低），提示激动剂通过诱导铁死亡损伤卵母细胞。

**3.3 NPY1R拮抗剂BIBO 3304改善老年小鼠卵巢功能与卵母细胞质量**
对12月龄衰老小鼠饲喂BIBO 3304 8周后，发情周期恢复正常，窦卵泡数量增加，卵母细胞数增多。TEM显示线粒体形态改善，Fe²⁺和ROS水平降低，JC-1红/绿比回升，表明拮抗剂减轻氧化应激并保护线粒体功能。

**3.4 NPY1R活性干预调节颗粒细胞炎症因子IL-6和NLRP3的表达**
在原代颗粒细胞中，NPY1R激动剂上调IL-6和NLRP3 mRNA，而拮抗剂BIBO 3304下调二者表达。在LPS（脂多糖）诱导的炎症模型中，BIBO 3304或siRNA敲低NPY1R均显著抑制LPS引起的IL-6和NLRP3升高，证实NPY1R直接调控炎症因子。

**3.5 NPY1R通过激活CREB磷酸化通路促进颗粒细胞炎症反应**
Western blot显示，激动剂处理原代颗粒细胞后p-CREB/CREB比值升高，拮抗剂则降低；过表达NPY1R上调p-CREB，敲低则抑制。使用CREB磷酸化抑制剂H-89可逆转NPY1R过表达或LPS诱导的IL-6和NLRP3上调，证明NPY1R通过p-CREB通路介导炎症。

**3.6 体内NPY1R干预调节卵巢卵泡中CREB信号激活并逆转炎症表型**
免疫荧光显示，年轻小鼠卵巢中p-CREB主要表达于颗粒细胞，衰老小鼠p-CREB信号在次级卵泡和窦卵泡阶段显著增强；NPY1R激动剂增加年轻小鼠卵泡中p-CREB，而BIBO 3304降低衰老小鼠卵泡中p-CREB。同时，IL-6和NLRP3在衰老小鼠卵泡中表达升高，主要位于颗粒细胞，BIBO 3304治疗显著抑制其表达。

**3.7 异常NPY1R激活加剧卵巢组织炎症和纤维化**
Western blot证实激动剂组卵巢中IL-6和NLRP3蛋白水平升高，拮抗剂组降低。PSR偏振光染色显示，年轻小鼠卵巢中I型胶原（粗大黄色/橙红色）和III型胶原（细绿色）分布正常；激动剂组I型胶原比例和I/III胶原比值显著增加，出现类似衰老样的纤维化；衰老小鼠中III型胶原减少、I型胶原增加，BIBO 3304治疗后III型胶原恢复，I/III比值降低，表明NPY1R拮抗剂逆转纤维化。

**讨论与结论**
研究讨论指出，衰老颗粒细胞的炎症反应是卵巢功能下降的关键机制，NPY1R/CREB信号轴在其中发挥核心调控作用。NPY1R异常高表达通过激活CREB磷酸化，促进IL-6和NLRP3释放，诱发铁死亡、线粒体功能障碍和胶原失衡，形成炎症-纤维化恶性循环。NPY1R拮抗剂BIBO 3304能有效阻断该通路，恢复卵巢微环境。研究结论翻译如下：
总之，衰老颗粒细胞的炎症反应是卵巢功能下降的关键机制，NPY1R-CREB信号轴在这一过程中发挥着关键的调控作用。虽然NPY1R拮抗作用对改善衰老小鼠卵巢功能有显著效果，但异常升高的NPY1R活性可能减弱这一干预效应。未来研究可进一步探索靶向NPY1R拮抗的治疗策略，以更有效地改善NPY1R过表达相关的卵巢功能障碍。同时，可扩大临床样本量，验证NPY1R作为卵巢衰老分子标志物和治疗靶点的临床价值。