TRMT10C通过转铁蛋白受体m1A甲基化修饰促进线粒体分裂并加重心房颤动进展

《Journal of Cell Communication and Signaling》：TRMT10C promotes mitochondrial fission through transferrin receptor m1A methylation modification and aggravates the progression of atrial fibrillation

　　

心房颤动（AF）是一种常见的心律失常，常伴有心房结构重构，尤其以纤维化及正常线粒体功能破坏为特征。N¹-甲基腺苷（m¹A）作为RNA甲基化修饰的一种，在多种生物学过程中发挥作用的认识正日益深入。本研究旨在探讨m¹A甲基转移酶tRNA甲基转移酶10C（TRMT10C）在心房颤动发病机制中的作用。研究结果显示，AF大鼠模型中TRMT10C及m¹A甲基化水平均上调，伴随过度线粒体分裂及心肌纤维化。敲低TRMT10C可抑制线粒体分裂相关蛋白Drp1和Fis1的表达水平，减少胶原沉积（包括I型胶原、Postn、III型胶原及纤连蛋白），并减缓AF进展。体外实验结果表明，TRMT10C敲低可抑制转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的心肌成纤维细胞增殖与迁移，而过表达转铁蛋白受体（TFRC）则可逆转该效应。机制上，TRMT10C通过促进m¹A甲基化增强TFRC mRNA的稳定性，进而驱动线粒体分裂与纤维化进程。综上，研究人员的发现阐明了一条驱动AF病理状态下线粒体动态失衡和纤维化的新型TRMT10C–TFRC m¹A轴，为心房疾病相关的细胞信号通路及潜在治疗靶点提供了新见解。

心房颤动（atrial fibrillation, AF)是临床最常见的心律失常类型之一，具有较高的死亡率和致残率。心房纤维化是AF进展过程中最典型的结构性改变，作为促进AF发生发展的重要病理因素，具有重要的诊断与治疗价值。然而，目前关于心房纤维化机制的研究尚未能提供有效的临床干预靶点。心肌纤维化以心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts, CFs）的增殖、迁移能力增强及后续胶原堆积为特征，该过程受线粒体代谢重编程（包括线粒体分裂）的驱动。异常线粒体分裂可能阻碍细胞增殖与迁移等细胞活动。线粒体分裂受线粒体分裂因子、MID49、MID51、动力相关蛋白1（dynamin-related protein 1, Drp1）及线粒体分裂1（mitochondrial fission 1, Fis1）蛋白等调控，但线粒体分裂是否在CFs增殖迁移中发挥关键作用及其在心房纤维化中的功能角色尚不明确。

动态可逆的RNA化学修饰对转录后基因调控至关重要。目前已发现超过100种转录后RNA修饰，如N⁶-甲基腺苷（m⁶A）、5-甲基胞苷（m⁵C）、N¹-甲基腺苷（m¹A）及假尿苷等，在细胞分化、蛋白质产生及生物学调控中发挥关键作用。m¹A由腺苷N¹位点连接甲基基团形成，因其甲基基团及正电荷改变，可显著改变RNA结构及蛋白-RNA相互作用强度。m¹A甲基化调控因子包括"写入者"（writers，如TRMT10C、TRMT61B、TRMT6、TRMT61A）、"擦除者"（erasers，如ALKBH1、ALKBH3）及"阅读者"（readers，如YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1）。近期研究表明，敲除甲基转移酶样蛋白3（methyltransferase-like 3, METTL3）可阻止缺血再灌注小鼠的病理线粒体分裂并改善炎症和心肌纤维化；而METTL3水平升高则促进AF患者心肌组织中线粒体分裂及心肌纤维化增加。基于此推测，转录后RNA修饰与线粒体动态失衡、心肌纤维化及AF进展相关，但AF条件下基于m¹A的mRNA修饰"图景"及潜在作用尚不清楚。

研究人员通过生物信息学挖掘相关差异表达基因，基于表达差异筛选出m¹A修饰"写入者"基因TRMT10C，并筛选出其调控的转铁蛋白受体（transferrin receptor, TFRC）因子，提出TRMT10C通过调控TFRC m¹A甲基化修饰促进线粒体动态失衡（过度分裂），进而诱导心肌纤维化并加重AF进展，并通过体内外实验加以验证。

该论文发表在《Journal of Cell Communication and Signaling》。

研究所用的主要关键技术方法包括：利用GEO数据库（样本来源：GSE126711芯片含3例AF大鼠样本及3例对照）进行生物信息学分析筛选差异表达基因；构建ACh-CaCl₂诱导的大鼠AF模型，通过尾静脉注射腺相关病毒（AAV）实现TRMT10C体内敲低；原代培养新生大鼠心脏CFs（Periostin阳性分选）并建立TGF-β1诱导的体外线粒体过度分裂模型；采用心电图记录及心房有效不应期（AERP）评估AF模型；透射电子显微镜观察线粒体超微结构；HE染色及Masson三色染色评估心房纤维化程度；CCK-8及EdU实验检测细胞活力与增殖；划痕愈合实验评估细胞迁移；MitoTracker Red CMXRos探针标记线粒体并测量线粒体长度；实时定量PCR及甲基化RNA免疫沉淀结合qPCR（m1A MeRIP-qPCR）检测m¹A修饰水平；放线菌素D（Act-D） chase实验评估mRNA稳定性；蛋白质免疫印迹（Western blot）检测蛋白表达。

**TRMT10C介导的线粒体动态失衡可能是AF进展的关键因素**

基于GEO数据库中AF芯片GSE126711（含经2天连续快速心房起搏反复诱导的3例大鼠AF样本及3例对照），研究人员通过limma差异分析筛选出33个差异基因（|log₂FC| > 1.2, p < 0.05），其中7个上调、26个下调。KOBAS分析显示这些基因与细胞外基质、蛋白结合、细胞因子介导信号通路、炎症反应、负调控线粒体融合、负调控巨噬细胞激活、活性氧应答、细胞死亡及心肌收缩等生物学过程显著相关。基于文献获取10个m¹A修饰调控因子，在GSE126711中仅TRMT10C和ALKBH3在AF组显著上调。Western blot验证TRMT10C和ALKBH3在AF组升高，点杂交（Dot blot）显示AF组心房组织中m¹A甲基化修饰水平上调。

**TRMT10C敲低抑制线粒体分裂、心房纤维化及AF进展**

通过尾静脉注射AAV实现TRMT10C敲低。Western blot证实TRMT10C蛋白在AF组上调，AAV注射后成功下调，其中shTRMT10C 1#组敲低效率更高。点杂交显示AF组升高的m¹A甲基化修饰水平在敲低后同步降低。大鼠体表心电图显示AF组P波时长和间期延长，敲低治疗后减缓。HE染色和Masson染色显示AF组心肌纤维松散水肿、炎症细胞浸润、坏死肌纤维被疏松纤维结缔组织替代、胶原纤维大面积沉积、心肌纤维细胞排列紊乱、部分心肌细胞空泡变性，敲低治疗后病理状态改善。AF组AF持续时间延长、AF易感性增加、AERP缩短，敲低治疗后这些因素均改善。Western blot检测纤维化相关蛋白显示其在AF组显著增加、敲低后显著下调。电子显微镜显示AF组及AAV-shNC组心肌纤维紊乱断裂、线粒体数量增多体积减小、部分空泡化，而AF + AAV-shTRMT10C 1#组表型恢复正常。Western blot显示线粒体分裂相关蛋白Drp1和Fis1在AF组上调、敲低后下调。

**TRMT10C敲低抑制心房成纤维细胞中线粒体分裂和纤维化**

从新生大鼠心脏提取CFs，Periostin阳性细胞鉴定为CFs。TGF-β1诱导建立CFs线粒体过度分化模型。Western blot证实shTRMT10C 1#和shTRMT10C 2#成功下调TRMT10C蛋白，shTRMT10C 1#组效率更高。点杂交显示TGF-β1组升高的m¹A甲基化修饰水平在TRMT10C敲低后同步降低。CCK-8和EdU实验显示TGF-β1组CF细胞活力和增殖增强，TRMT10C敲低后抑制。划痕愈合实验显示TGF-β1组CF细胞迁移能力增强，TRMT10C敲低后抑制。MitoTracker染色及Western blot显示TGF-β1组CF细胞线粒体长度缩短、Drp1和Fis1表达增加，TRMT10C敲低后线粒体长度增加、Drp1和Fis1表达受抑。Western blot检测纤维化相关蛋白显示TGF-β1组显著增加，TRMT10C敲低后显著降低。

**TRMT10C调控因子的生物信息学分析**

对33个差异表达基因进行Pearson相关分析，发现TFRC与TRMT10C正相关且相关性最大。GSE126711中AF组TFRC显著上调。m¹A甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）检测显示TRMT10C敲低后TFRC mRNA的m¹A修饰水平降低，表明TRMT10C可能通过m¹A修饰调控TFRC。qPCR显示TGF-β1刺激后TFRC表达增加，TRMT10C敲低后下调。Act-D检测mRNA稳定性显示TRMT10C敲低后TFRC RNA稳定性降低。

**TRMT10C通过促进TFRC m¹A甲基化修饰促进CFs线粒体分裂和纤维化**

构建TRMT10C敲低联合TFRC过表达质粒。Western blot显示：与OE-NC + sh-NC和OE-TFRC + sh-NC相比，OE-NC + sh-TRMT10C-1和OE-TFRC + sh-TRMT10C-1组TRMT10C蛋白表达下调；与OE-NC + sh-NC相比，OE-TFRC + sh-NC组TFRC蛋白表达上调，OE-NC + sh-TRMT10C-1组TFRC下调，OE-TFRC + sh-TRMT10C-1组较OE-NC + sh-TRMT10C-1组升高。表明TFRC表达不影响TRMT10C蛋白表达，而TRMT10C影响TFRC蛋白表达，TFRC是TRMT10C的下游因子。TGF-β1刺激下，点杂交显示OE-NC + sh-TRMT10C-1和OE-TFRC + sh-TRMT10C-1组较相应对照组甲基化修饰水平降低。CCK-8和EdU实验显示TFRC过表达促进、TRMT10C敲低抑制CF细胞活力和增殖。划痕愈合实验显示TFRC过表达增强、TRMT10C敲低抑制CF细胞迁移。MitoTracker染色显示TFRC过表达后CF细胞线粒体长度缩短，TRMT10C敲低后增加。Western blot显示TFRC过表达后线粒体分裂相关蛋白和纤维化相关蛋白显著上调，TRMT10C敲低后显著下调。TFRC过表达可拮抗TRMT10C敲低引起的所有效应。

**讨论与结论**

AF是临床最常见的室上性心律失常之一，其发病机制与心房纤维化密切相关，而心房纤维化的核心在于CFs的异常增殖、迁移及胶原沉积。该研究发现TRMT10C通过调控TFRC的m¹A甲基化修饰驱动线粒体分裂，进而促进心房纤维化和AF进展，为AF病理机制提供了新视角。

心房纤维化以CFs过度激活和后续细胞外基质（extracellular matrix, ECM）沉积为标志，为AF发生和持续提供结构性基质。该研究中，AF模型大鼠心房组织中TRMT10C表达增加，伴随线粒体分裂相关蛋白Drp1和Fis1的激活，提示异常线粒体分裂可能连接TRMT10C与纤维化。前期报道显示过度线粒体分裂可通过调控细胞代谢和氧化应激促进成纤维细胞激活，而抑制线粒体分裂可减轻心肌纤维化。此前研究证实METTL3通过m⁶A修饰促进线粒体分裂。值得注意的是，该研究观察到敲低TRMT10C可显著抑制TGF-β1诱导的CF线粒体分裂并减少胶原沉积，提示RNA甲基化可能是调控线粒体动态平衡的常见机制。

RNA甲基化修饰是基因表达的关键调控模式，其在心血管疾病中的作用正逐步被揭示。在心脏病中，METTL3介导的m⁶A修饰可通过调控长链非编码RNA GAS5促进线粒体分裂和纤维化。近年来其他类型甲基化逐渐被认识。该研究揭示AF大鼠心房组织中m¹A甲基化水平升高，TRMT10C作为m¹A的"写入者"蛋白，其敲低可减少TFRC的m¹A修饰水平。前期报道m¹A修饰通过影响mRNA稳定性和翻译效率促进细胞分化和应激反应，而TRMT10C介导的m¹A修饰对TFRC的调控是AF中的新发现，但目前关于m¹A修饰与线粒体动态平衡直接关联的研究有限，需进一步探索其他m¹A调控因子在AF中的作用。

TFRC是广泛存在于细胞膜表面的跨膜糖蛋白，在细胞铁摄取过程中发挥关键作用。TFRC可特异性结合转铁蛋白，介导细胞铁摄取以满足细胞生长、增殖及维持正常生理功能的铁需求。TFRC在AF中显著上调，文献报道转铁蛋白受体1（TFR1）敲除可改善线粒体膜电位、增加ATP含量、下调线粒体分裂蛋白并上调线粒体融合蛋白；TFRC在冠心病和AF中高表达。鉴于AF大鼠心房组织中m¹A甲基化水平与TRMT10C同步升高，且TRMT10C是m¹A的"写入者"蛋白，研究人员推测TRMT10C可能介导TFRC的m¹A修饰从而影响AF。该研究证实TRMT10C通过促进m¹A甲基化增强TFRC mRNA稳定性，进而驱动线粒体分裂。作为转铁蛋白受体，TFRC功能主要与铁代谢相关，但该研究首次发现其在CF线粒体动态调控中的作用。机制上，m¹A修饰可能改变TFRC mRNA的二级结构，使其逃避核酸酶降解，这与YTHDF家族蛋白识别m¹A位点调控mRNA稳定性的模式相似。此外，TFRC过表达可逆转TRMT10C敲低引起的线粒体分裂受抑和纤维化减少，提示TFRC是TRMT10C的直接下游靶点。

该研究首次提出TRMT10C在AF中通过调控TFRC m¹A甲基化修饰的作用，为AF防治提供了潜在靶点。靶向TRMT10C或TFRC m¹A修饰可能成为抑制心房纤维化的新策略。未来可进一步阐明TFRC m¹A修饰的具体位点，通过甲基化测序定位关键修饰位点以更精准地调控靶基因和治疗AF。

研究结论：TRMT10C通过促进TFRC mRNA的m¹A甲基化修饰增强其稳定性，驱动线粒体过度分裂，进而促进心房纤维化及AF进展。该研究揭示了TRMT10C–TFRC m¹A甲基化轴在AF病理机制中的新作用，为AF治疗提供了潜在的新靶点。