《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：RNA Metabolism Genes as Prognostic Biomarkers and Therapeutic Targets in Colorectal Cancer Based on the Analysis of Single-Cell and Bulk-RNA Sequencing Data
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结直肠癌（CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，且仍然是癌症相关死亡的重要原因。越来越多的证据表明，RNA代谢异常促进肿瘤的发生、进展及治疗耐药。在本研究中，研究人员整合单细胞RNA测序和Bulk转录组数据，以鉴定与CRC进展相关的RNA代谢相关基因（RMRGs
结直肠癌（CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，且仍然是癌症相关死亡的重要原因。越来越多的证据表明，RNA代谢异常促进肿瘤的发生、进展及治疗耐药。在本研究中，研究人员整合单细胞RNA测序和Bulk转录组数据，以鉴定与CRC进展相关的RNA代谢相关基因（RMRGs），并评估其临床意义。通过综合生物信息学分析，共鉴定出39个差异表达的RMRGs，其中高RMRG活性主要富集于上皮细胞群体。细胞—细胞通讯分析显示，肿瘤微环境中上皮细胞与其他细胞类型之间的相互作用增强。进一步整合单细胞与Bulk RNA测序数据后，鉴定出PCBP3和NGRN为关键预后基因。基于PCBP3和NGRN构建了一个双基因预后模型，并在独立队列中得到验证，显示出良好的预测性能。Human Protein Atlas数据进一步证实，这两种蛋白在结直肠癌组织中均有表达。免疫浸润分析表明，PCBP3和NGRN与不同的免疫细胞浸润模式及免疫治疗相关免疫状态有关。功能实验表明，沉默PCBP3或NGRN可显著抑制HCT116结直肠癌细胞的增殖和侵袭。此外，Western blot分析提示，这些作用至少部分可能通过调控PI3K/AKT信号通路介导。综上，本研究鉴定出PCBP3和NGRN是结直肠癌中具有前景的预后生物标志物和潜在治疗靶点，并为理解RNA代谢在结直肠癌进展及肿瘤免疫调控中的作用提供了新的见解。
该文发表于《Journal of Cellular and Molecular Medicine》，聚焦RNA代谢异常在结直肠癌（CRC）发生发展中的作用及其临床转化价值。结直肠癌是全球高发且高致死性的消化系统恶性肿瘤，疾病异质性显著，不同患者在分子特征、肿瘤微环境、治疗反应和预后方面存在明显差异。当前，CRC的发病机制和演进过程尚未被完全阐明，临床上仍缺乏足够稳定、可推广的早期筛查和预后评估标志物，这使得部分患者在疾病进展后才被诊断，错失最佳干预时机。与此同时，RNA代谢（RNA metabolism）涵盖RNA的合成、加工、修饰、转运、翻译与降解等多个环节，其失衡已被证实与肿瘤细胞增殖、侵袭、免疫逃逸及耐药密切相关。因此，从RNA代谢相关基因（RMRGs）中筛选具有预后价值和治疗潜能的关键分子，对于完善CRC的分层管理和机制研究具有重要意义。
基于上述问题，研究人员整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）与Bulk RNA测序数据，对结直肠癌组织与正常组织进行联合分析，试图在细胞分辨率和整体转录组层面同时识别驱动CRC进展的RNA代谢相关分子。研究首先在单细胞层面解析肿瘤组织的细胞组成，识别恶性上皮细胞群，并进一步结合TCGA与GEO数据库中的大样本转录组数据，筛选与预后密切相关的核心基因。最终，PCBP3与NGRN被确定为最具代表性的关键预后基因，并据此构建双基因风险模型。该模型在TCGA以及多个GEO独立队列中均表现出较好的预测能力，提示其具有较强的稳健性和临床应用前景。进一步的蛋白水平证据显示，PCBP3和NGRN在结直肠癌组织中均可检测到，支持其生物学相关性。功能实验进一步证实，沉默这两个基因后，HCT116细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力均显著下降，说明二者不仅具有统计学上的预后关联，也参与CRC恶性表型的维持。Western blot结果进一步提示，PCBP3和NGRN的作用至少部分可能经由PI3K/AKT信号通路实现。综合而言，研究建立了从单细胞图谱、转录组筛选、预后建模到功能验证的一体化研究框架，证明PCBP3和NGRN是CRC中值得关注的预后生物标志物和候选治疗靶点。
从研究方法看，作者主要采用以下几类关键技术。其一，利用GEO中的GSE200997单细胞队列以及GSE17536、GSE38832微阵列队列，并结合TCGA CRC转录组数据开展整合分析；单细胞数据通过Seurat、Harmony和UMAP进行标准化、去批次与降维聚类，并以inferCNV识别恶性上皮细胞。其二，采用limma、LASSO回归、随机森林、SVM-RFE及Cox回归筛选预后基因并构建风险模型。其三，借助CellChat、monocle3、PySCENIC与CIBERSORTx分析细胞通讯、拟时序演化、转录因子调控及免疫浸润。其四，使用NCM-460和HCT116细胞，通过RT-qPCR、CCK-8、克隆形成实验、Transwell及Western blot进行体外功能验证。
在结果部分，论文依次呈现了多个层面的发现。
3.1 Identification of Tumour Cells and Acquisition of Differential Genes
研究人员首先对单细胞测序数据进行标准化处理和聚类分析，识别出T细胞、B细胞、上皮细胞、浆细胞、成纤维细胞、髓系细胞和内皮细胞7类主要细胞群。通过比较正常组织与肿瘤组织的细胞比例，发现肿瘤组织中上皮细胞显著富集。随后结合拷贝数变异（CNV）分析，确认部分上皮细胞簇具有更高CNV水平，因而被界定为肿瘤上皮细胞。该结果说明，CRC肿瘤组织中的上皮细胞不仅数量增加，而且表现出明确的恶性分子特征，为后续差异基因筛选提供了关键细胞基础。
3.2 Screening of the Most Appropriate Differential Genes Affecting Prognosis
研究将单细胞测序中肿瘤上皮细胞上调基因与TCGA队列中肿瘤组织上调基因进行交集分析，获得690个候选基因。进一步经LASSO回归、随机森林和支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）等机器学习方法层层筛选，并结合单因素和多因素Cox回归分析，最终确定PCBP3和NGRN为与患者预后关联最强的关键基因。该结果表明，这两个基因兼具表达差异性和预后相关性，是后续模型构建与机制研究的核心分子。
3.3 The Gene Pair Prognosis Model Composed of PCBP3 and NGRN Can Be Used as Potential Biomarkers for Cancer Prognosis
在确定关键基因后，研究人员基于PCBP3和NGRN构建双基因Cox预后模型，并在TCGA、GSE17536和GSE38832队列中进行验证。结果显示，高风险组患者生存结局更差，模型在多个时间点的AUC具有较好表现，说明该模型对总体生存（OS）的预测具有稳定性。与此同时，Human Protein Atlas（HPA）中的免疫组织化学结果显示，PCBP3和NGRN蛋白在结直肠癌组织中均可检测到，从蛋白层面补充了转录组分析结果，增强了其作为候选预后标志物的可信度。
3.4 Comparative Analysis of Methylation Differences and Influencing Gene Differences in High and Low Risk Groups
围绕PCBP3/NGRN风险分组，研究进一步分析高低风险组之间的甲基化相关差异基因及功能通路变化。结果显示，高风险组上调基因主要富集于PI3K-Akt signalling pathway和AMPK signalling pathway，提示这些信号轴可能与高风险表型对应的细胞生存及代谢调控增强有关。GO富集分析进一步表明，相关差异基因涉及肌肉收缩、硫化物代谢过程及胚胎器官发育等生物学过程。该部分结果提示，高低风险组之间不仅存在表达差异，也伴随表观遗传调控和功能通路重塑。
3.5 Comparative Analysis of Immune Infiltration Differences Between High and Low-Risk Groups
基于CIBERSORTx免疫浸润分析，研究发现高低风险组在多种免疫细胞组成上存在差异，其中Macrophages M0和Macrophages M2差异最为显著。相关性分析显示，NGRN主要与NK细胞和树突状细胞相关，而PCBP3主要与Macrophages M0/M2及肥大细胞相关。这意味着PCBP3与NGRN可能通过不同的免疫调节路径影响CRC进展。补充的IPS分析进一步显示，IPS_High组PCBP3和NGRN表达更低，且Macrophages M0/M2浸润减少、活化NK细胞水平升高，提示较低的PCBP3/NGRN表达可能对应更活跃的免疫微环境及更有利的免疫治疗相关状态。
3.6 Analysis of NGRN and PCBP3 in Different Cancer Species
在泛癌层面，研究进一步评估NGRN和PCBP3与免疫浸润及总体生存的关系。结果表明，两者在多种肿瘤类型中均与免疫细胞浸润显著相关，并且其高低表达与不同癌种的OS存在不同方向的联系。这一结果提示，PCBP3和NGRN并非仅在CRC中具有生物学意义，而可能在更广泛的肿瘤背景下参与肿瘤免疫和疾病进程调控，但其具体效应具有癌种依赖性。
3.7 Analysis of Cell Interactions and Transcription Factor Regulatory Networks
研究人员将Bulk转录组风险模型映射回单细胞数据，对高低风险组进行细胞通讯和转录因子调控网络比较。结果显示，高风险组中上皮细胞与其他细胞类型之间的相互作用更加频繁，尤其是MIF相关通路与CD44相关通路显著激活，提示高风险状态下肿瘤细胞与微环境的互作增强。进一步的转录因子模块分析显示，上皮细胞可分为4个转录调控模块，其中部分模块在不同风险组间存在明显差异，且CDK2的表达在高风险组显著不同。该结果提示，风险模型可能对应不同的细胞通讯格局和转录调控状态。
3.8 Pseudo Timing Difference Between Tumour and Normal Tissue
为了刻画正常上皮向肿瘤上皮转变过程中的动态变化，研究应用monocle3进行拟时序分析。结果显示，正常组织与肿瘤组织上皮细胞沿分化轨迹呈现连续变化，并筛选出在轨迹中变化最显著的基因。SPINK4在正常组织中表达较集中，且随肿瘤进展逐渐下降；TCGA生存分析进一步表明，SPINK4高表达患者预后更好，提示该基因可能具有保护性意义。该部分结果揭示了CRC上皮细胞恶性转化过程中的动态分子改变。
3.9 PCBP3 and NGRN Increased Cell Proliferation and Invasion of HCT Cells
体外实验结果表明，HCT116细胞中PCBP3和NGRN的mRNA表达均高于正常结肠上皮细胞NCM-460。采用siRNA沉默PCBP3或NGRN后，HCT116细胞的增殖能力、克隆形成能力及侵袭能力均显著下降，说明二者促进CRC细胞恶性生物学行为。进一步Western blot显示，沉默这两个基因后，p-PI3K和p-AKT表达下降，而β-actin保持稳定，提示PCBP3和NGRN可能至少部分通过激活PI3K/AKT signalling pathway促进CRC进展。
讨论部分强调，RNA代谢异常是CRC发生发展的重要分子基础，而单一组学往往难以同时兼顾细胞异质性和总体转录特征。本研究通过整合单细胞与Bulk RNA测序数据，系统识别出与CRC进展及预后显著相关的RNA代谢核心基因，并通过外部队列、蛋白水平和体外功能实验进行多层次验证。研究不仅说明PCBP3和NGRN具有较强的预后评估价值，还提示其可能参与肿瘤免疫微环境重塑和免疫治疗相关状态调控。特别是与Macrophages M0/M2、NK细胞、MIF/CD44细胞通讯轴以及PI3K/AKT信号通路相关的发现，使该研究从生物标志物筛选进一步延伸至潜在机制层面。论文同时指出，目前蛋白水平验证、机制阐释及免疫治疗队列中的临床验证仍需进一步扩大和深化，这也说明研究结论具有良好的延展空间，但现阶段仍以原文呈现的证据为主。
研究结论部分可译为：总之，本研究整合单细胞与Bulk RNA测序数据，鉴定出PCBP3和NGRN是结直肠癌中具有预后意义的重要RNA代谢相关基因。研究建立了一个可靠的双基因风险模型，并在TCGA队列及独立GEO数据集中显示出良好的预测性能。新增的HPA免疫组织化学分析进一步支持PCBP3和NGRN在结直肠癌组织中的蛋白表达。功能实验表明，敲低PCBP3和NGRN可抑制HCT116细胞的增殖和侵袭，而新增的Western blot结果提示，这些效应至少部分可能通过PI3K/AKT信号通路介导。此外，补充的基于IPS的分析显示，较低的PCBP3/NGRN表达与较低的Macrophages M0/M2浸润及较高的活化NK细胞水平相关，提示这些基因还可能与免疫治疗相关免疫状态有关。综合来看，这些发现支持PCBP3和NGRN作为结直肠癌潜在预后生物标志物和候选治疗靶点，同时提示其可能与肿瘤免疫调控及免疫治疗应答相关。进一步在更大临床队列中的验证及机制研究，仍是推动其转化应用所必需的步骤。
