肿瘤来源细胞外囊泡（tumour-derived extracellular vesicles）通过巨噬细胞介导髓系抑制性细胞（MDSCs）聚集诱导弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）进展

《Journal of Extracellular Vesicles》：Tumour-Derived Extracellular Vesicles Induce Diffuse Large B-Cell Lymphoma Progression Through Macrophage-Mediated MDSC Accumulation

　　

外周血髓系抑制性细胞（MDSCs）水平升高预示弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者抗瘤免疫受抑及预后不良。研究人员证实肿瘤来源细胞外囊泡（EVs）作为信使，将胆固醇从淋巴瘤细胞递送至巨噬细胞。巨噬细胞通过内化肿瘤来源EVs而被激活，并经NLRP3/IL-1β轴分泌IL-1β，进而导致IL-1β介导的MDSC扩增，以及DLBCL中T细胞抑制与耗竭。此外，体内外巨噬细胞耗竭阻碍了肿瘤来源EVs诱导的MDSC浸润。用二甲双胍药理抑制胆固醇代谢可减少DLBCL细胞EVs分泌，伴随IL-1β分泌及MDSC聚集降低。因此研究人员得出结论：肿瘤来源EVs以巨噬细胞依赖方式诱导MDSC聚集，并可通过二甲双胍抑制DLBCL中胆固醇生物合成而靶向干预。

论文发表于《Journal of Extracellular Vesicles》。研究背景：弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL，diffuse large B-cell lymphoma）是最常见非霍奇金淋巴瘤，虽有R-CHOP一线方案可使约60%患者长期缓解，但其余40%复发/难治患者预后差。肿瘤微环境（TME，tumor microenvironment）是决定DLBCL进展与耐药的核心因素，其中髓系抑制性细胞（MDSCs，myeloid-derived suppressor cells）及肿瘤相关巨噬细胞（TAMs，tumor-associated macrophages）被认为是不良预后标志物，但淋巴瘤细胞与这些免疫抑制细胞互作机制及微环境空间异质性尚不清楚。胆固醇代谢重编程可促进肿瘤发生，肿瘤细胞常通过ATP结合盒亚家族A成员1（ABCA1，ATP-binding cassette subfamily A member 1）和细胞外囊泡（EVs，extracellular vesicles）分泌胆固醇，实体瘤中肿瘤EVs可递送胆固醇至MDSCs促其扩增，但DLBCL中肿瘤来源EVs是否及如何通过胆固醇关联机制重塑免疫抑制微环境尚不明确。为此研究人员开展研究，明确肿瘤来源EVs以巨噬细胞依赖方式递送胆固醇激活NLRP3/IL-1β轴促MDSC聚集，二甲双胍通过抑制胆固醇合成减少EVs分泌并改善免疫抑制微环境，为DLBCL免疫靶向治疗提供新依据。

主要关键技术方法：研究采用多中心临床样本队列（161例新诊断DLBCL患者外周血、84例肿瘤组织RNA-seq数据、部分患者血清EVs及二甲双胍治疗前后配对样本，另纳入健康供者对照）；建立DLBCL细胞系（OCI-LY1、HBL1）及THP-1巨噬细胞体外共培养体系、人外周血单个核细胞（PBMCs，peripheral blood mononuclear cells）诱导分化模型；构建小鼠A20皮下移植瘤模型，设二甲双胍体内处理组、氯膦酸脂质体体内巨噬细胞耗竭组；采用慢病毒shRNA敲低SREBF2（固醇调节元件结合转录因子2）及小分子抑制剂（二甲双胍、fatostatin）干预胆固醇合成；通过超速离心与尺寸排阻色谱（SEC，size exclusion chromatography）分离EVs；制备胆固醇负载脂质纳米颗粒（Chol-LNPs，cholesterol-loaded lipid nanoparticles）作为对照；综合多色流式细胞术免疫分型、纳米颗粒追踪分析（NTA，nanoparticle tracking analysis）、透射电镜（TEM，transmission electron microscopy）、Western blot、RT-qPCR、酶联免疫吸附试验（ELISA，enzyme-linked immunosorbent assay）、共聚焦激光扫描显微镜（LSCM，laser scanning confocal microscopy）、bulk RNA-seq与单细胞RNA-seq（scRNA-seq，single cell RNA-seq）、基因集富集分析（GSEA，gene set enrichment analysis）、CIBERSORT与ssGSEA免疫去卷积、Filipin III染色与Amplex Red法胆固醇定量、体内外药效与存活分析等方法开展系统研究。

2.1 Peripheral Blood MDSCs Link to Tumour Progression in DLBCL：通过对161例DLBCL患者与14例健康供者外周血多色流式免疫分型，研究人员发现DLBCL患者MDSCs（Lin-HLA-DR^low/?CD33⁺CD11b⁺）比例显著高于健康对照，但GCB与non-GCB亚型间无差异；按ROC曲线分为MDSCs高（n=92）与低（n=69）组，MDSCs高水平与更差无进展生存（PFS，progression-free survival）和总生存（OS，overall survival）相关，且关联晚期Ann Arbor分期与高危国际预后指数（IPI，international prognostic index）；tSNE降维显示MDSCs高组T细胞浸润减少，CD4⁺与CD8⁺T细胞比例降低；MDSCs高组外周血IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α浓度升高；外周血巨噬细胞比例与MDSCs比例呈正相关。

2.2 Peripheral Blood MDSCs Reflect Immunosuppressive Tumour Microenvironment in DLBCL：对84例肿瘤组织RNA-seq按外周血MDSCs高低分组做GSEA，MDSCs高组富集髓系细胞分化、迁移及免疫相关通路；跟踪肿瘤免疫表型（TIP，tracking tumour immunotype）分析显示外周血MDSCs比例与肿瘤内MDSC招募评分正相关；MDSCs高组肿瘤中CXCR2、OLR1（LOX1）、COX2、IL1B表达上调；MDSC招募评分与IL1B表达及巨噬细胞浸润评分相关性最高，且IL1B表达与巨噬细胞浸润评分正相关，scRNA-seq显示IL1B主要在巨噬细胞中富集。

2.3 Tumour-Derived Extracellular Vesicles Induce Macrophage Activation and MDSC Accumulation：肿瘤RNA-seq显示MDSCs高组富集胆固醇稳态、炎症应答、IL6-JAK-STAT3、囊泡分泌等通路，患者来源血清EVs可增加PBMCs中MDSCs比例；DLBCL细胞系来源EVs经TEM、NTA、Western blot鉴定（阳性HSP70、TSG101、CD63，阴性GM130），EVs刺激PBMCs增MDSCs依赖单核细胞/巨噬细胞存在（单核细胞去除后无显著增加）；体内巨噬细胞耗竭（氯膦酸脂质体）减缓A20瘤生长，肿瘤巨噬细胞与PMN-MDSCs（多形核MDSCs）减少；PKH26标记EVs被THP-1巨噬细胞摄取，可被巨噬细胞大胞饮抑制剂amiloride、脂筏抑制剂MβCD、网格蛋白依赖内吞抑制剂氯丙嗪阻断；EVs刺激上调巨噬NLRP3、IL1B mRNA/蛋白及上清IL-1β（超速离心与SEC纯化EVs结论一致），摄取阻断后该上调被抑制；EVs刺激后巨噬细胞上清促PBMCs中MDSCs比例增加，外源IL-1β（10 ng/ml）亦可增MDSCs；胆固醇负载脂质纳米颗粒（Chol-LNPs）模拟EVs胆固醇效应，可上调NLRP3/IL1B及IL-1β并促MDSCs，且依赖摄取途径，而无胆固醇对照（con-LNPs）无此作用。

2.4 Inhibition of Cholesterol Synthesis in Tumour Cells Counteracts Macrophage-Mediated MDSC Accumulation：慢病毒shSREBF2敲低DLBCL细胞SREBF2降低细胞增殖与增凋亡，下调SREBF2、LDLR、HMGCR表达，降低细胞与上清总胆固醇，减少EVs分泌量与EVs胆固醇含量，此类EVs刺激巨噬细胞后NLRP3/IL1B表达、IL-1β分泌及PBMCs中MDSCs比例均下降；用二甲双胍（2 mM）或fatostatin（10 μM）处理DLBCL细胞，下调SREBF2、LDLR、HMGCR蛋白，降低细胞胆固醇与总胆固醇，减少EVs分泌量及EVs胆固醇含量（EVs粒径无变），此类低胆固醇EVs刺激巨噬细胞后NLRP3/IL1B、IL-1β分泌降低，PBMCs中MDSCs比例下降，且CD4⁺、CD8⁺T细胞PD-1表达降低，CD8⁺T细胞颗粒酶B（GZMB，granzyme B）与IFN-γ升高。

2.5 Metformin Inhibits MDSC Infiltration and Improves the Tumour Microenvironment in Vivo：A20荷瘤小鼠予二甲双胍（100 mg/kg）腹腔注射，肿瘤生长受抑，血清总胆固醇、血清EVs量及EVs胆固醇含量降低；肿瘤内Nlrp3、Il1b mRNA/蛋白表达及血清IL-1β浓度降低；肿瘤内MDSCs（CD11b⁺Ly6C/Ly6G⁺）总群减少，主要为PMN-MDSCs（Ly6C^?Ly6G⁺）减少，M-MDSCs（Ly6C⁺Ly6G^?）无显著变化；CD8⁺T细胞PD-1降低、GZMB升高，提示免疫抑制微环境改善。

2.6 Metformin Attenuates the Immunosuppressive Tumour Microenvironment and Improves Clinical Outcome of DLBCL Patients：DLBCL患者二甲双胍治疗前后配对分析显示，治疗后血清EVs总量与EVs胆固醇降低，血清IL-1β降低，PBMCs中MDSCs比例降低，CD4⁺与CD8⁺T细胞PD-1表达降低；在临床试验（ChiCTR-OIN-17012130）中，外周血MDSCs高的DLBCL/FL3b完全缓解患者接受二甲双胍维持治疗（n=22）对比未维持组（n=60），两年PFS（86.36% vs 62.25%，P=0.055）与两年OS（95.46% vs 70.97%，P=0.025）更长。

讨论部分总结：研究人员指出MDSCs抑制抗肿瘤免疫促DLBCL进展，本研究阐明DLBCL来源胆固醇富集EVs被巨噬细胞摄取，激活NLRP3炎症小体/IL-1β轴，以巨噬细胞依赖方式诱导MDSC聚集，重塑免疫抑制微环境；胆固醇是EVs激活巨噬细胞的关键组分之一，由胆固醇合成干扰（shSREBF2、fatostatin）或二甲双胍抑制mTOR/SREBF2通路降低EVs胆固醇，可减弱巨噬细胞活化、IL-1β释放、MDSC扩增及T细胞耗竭；二甲双胍除间接通过降低肿瘤EVs胆固醇影响微环境，也有直接抗炎（NF-κB、NLRP3抑制）等效应；Chol-LNPs实验排除其他肿瘤物质干扰，确证胆固醇本身足以激活巨噬细胞NLRP3/IL-1β；研究局限包括EV分离（超速离心/SEC）可能残留非囊泡蛋白污染，但两种方法及Chol-LNPs均一致上调NLRP3/IL1B，说明结论稳健，未来需更高纯度EV制备。结论：DLBCL细胞胆固醇代谢重编程通过富胆固醇EVs调控肿瘤微环境，靶向胆固醇生物合成（如二甲双胍）是DLBCL免疫靶向治疗的潜在策略。