跨测量技术的细胞外囊泡表征变异性评估

《Journal of Extracellular Biology》：Evaluating Variability in Extracellular Vesicle Characterization Across Measurement Techniques

　　

细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）的可靠、可重复且标准化表征，仍然由于不同分析平台之间的方法学变异性，以及不同生物体液内部及其相互之间EV固有异质性，而构成核心挑战。本研究评估了采用超速离心（ultracentrifugation，UC）从去分化脂肪肉瘤条件培养基和商业化健康供体尿液中分离的EVs。研究人员使用三种广泛应用的仪器——NanoFCM、CytoFLEX Nano和ZetaView Evolution——对分离EVs进行了物理表征及表面四跨膜蛋白（tetraspanin）谱分析。所有平台均一致检出小型EVs；然而，绝对粒径分布、颗粒浓度及四跨膜蛋白表达水平均存在差异，反映了光学构型、检测原理及荧光背景敏感性的不同。此外，研究人员采用两种不同方法对EV相关DNA进行了定量，结果进一步显示DNA产量与定量值均存在变异。综上，这些观察结果突出表明EV分析具有方法依赖性，并强调在跨生物体液解读EV数据时，必须审慎考虑各仪器特异性指标。

该论文发表于《Journal of Extracellular Biology》，聚焦于细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）表征标准化这一领域关键问题。EVs是由几乎所有细胞主动分泌的纳米级脂质双层膜性颗粒，广泛存在于血液、尿液、唾液及组织中，携带蛋白质、脂质、RNA和DNA等分子货物，参与细胞间通讯，并与免疫调控、肿瘤进展、组织修复等多种生理及病理过程密切相关。随着EVs在疾病诊断、预后评估、治疗开发及疫苗研究中的应用价值不断提升，如何实现对其大小、浓度、表面标志物和核酸货物的可靠检测，成为推动该领域转化应用的基础问题。尽管MISEV 2023指南已对EV研究的最小信息报告提出规范，但不同商业平台采用彼此不同的光学和分析原理，导致同一样本在不同系统中的测量结果缺乏一致性，阻碍了跨研究比较，也限制了稳健标准化方法的建立。正是在这一背景下，研究人员开展了本项研究，目的在于系统比较不同分析平台对不同来源EVs的检测表现，明确方法依赖性差异，并为未来EV分析标准化策略提供依据。

研究人员围绕两类具有代表性的EV来源展开研究：其一为去分化脂肪肉瘤细胞系Lipo246条件培养基来源EVs，其二为健康供体尿液来源EVs（uEVs）。前者代表较为均一的肿瘤细胞来源体系，后者则代表成分复杂、具有生理相关性的真实生物体液。研究显示，尽管NanoFCM、CytoFLEX Nano和ZetaView Evolution三种平台均可稳定检出小EVs，但在粒径分布、颗粒浓度、CD81与CD63两种四跨膜蛋白阳性事件比例，以及EV相关DNA定量结果方面均存在明显差异。这些差异并不单纯反映生物学差别，而更多体现为检测原理、光学配置、校准策略和背景信号敏感性的不同。研究的重要意义在于：它通过同一EV制备样本的多平台平行评估，直接证明了EV表征结果高度依赖具体方法和仪器，提示研究者在解读跨平台、跨生物体液EV数据时，必须结合平台特异性限制进行谨慎判断，并应尽可能使用正交技术（orthogonal methods，不同原理互补方法）进行验证。

本研究主要采用以下关键技术方法。研究样本包括Lipo246去分化脂肪肉瘤细胞条件培养基以及商业化健康供体尿液样本。EVs均通过差速离心联合超速离心（UC）分离，尿液样本另采用蔗糖垫步骤降低共分离杂质。研究人员以透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）观察EV形态并进行图像基础粒径测量，以Western blot（蛋白质印迹）验证EV标志蛋白富集情况；随后采用NanoFCM、CytoFLEX Nano和ZetaView Evolution三种平台，从散射与荧光两个维度评估EV粒径、浓度及CD63、CD81表面表型；最后使用QIAamp试剂盒提取EV相关DNA，并分别通过NanoDrop分光光度法和Qubit荧光定量法测定DNA含量。统计分析采用双侧Student's t检验，部分粒径分布比较结合Wilcoxon秩和检验。

在“3.1 EV Detection”部分，研究人员首先确认所分离颗粒确属EVs。TEM结果显示，无论是脂肪肉瘤条件培养基来源EVs还是尿液来源uEVs，均可见具有典型杯状形态的膜性囊泡结构，提示EVs分离成功且结构完整。LCCM-EVs的平均直径为64 ± 33 nm，中位数为51 nm；uEVs平均直径为73 ± 30 nm，中位数为66 nm。进一步统计表明，两者粒径分布差异具有统计学意义。研究据此指出，尿液来源EVs由于起源于肾单位和尿路多个细胞类型，预期具有更高异质性及更大囊泡亚群比例；相比之下，LCCM-EVs来自较均一的细胞群体，因此尺寸更小且更一致。Western blot结果则显示，两类EV组分中均富集CD9和TSG101，支持EV特征；LCCM-EVs中未检出Calnexin，提示细胞污染较低；uEVs中检出尿调蛋白（uromodulin），符合尿液EV制备中常见共分离蛋白特征。

在“3.2 Comparative Assessment of EVs”部分，研究重点比较三种平台对EVs物理性质和表面标志物的评估差异。

在“3.2.1 LCCM-EVs”小节中，三种仪器均检测到以<200 nm为主的小EV富集群，但绝对粒径与颗粒浓度差异显著。未染色LCCM-EVs在散射模式下，ZetaView Evolution测得总颗粒浓度最高，为4.59 × 10⁹ particles/mL；CytoFLEX Nano次之，为2.67 × 10⁸ particles/mL；NanoFCM最低，为2.86 × 10⁷ particles/mL。三者测得平均粒径分别为86 ± 54 nm、77 ± 45 nm和82 ± 22 nm，显示不同平台虽然都指向小EV群体，但结果并不一致。抗体染色后，各平台测得粒径整体向更大范围偏移，尤以CD63标记样本最明显，提示抗体复合物形成或标记诱导聚集可影响表观粒径。荧光模式下，CD81阳性EV比例分别为NanoFCM 4.3%、ZetaView 3.3%、CytoFLEX 2.8%；CD63阳性EV比例则分别为18.0%、9.8%和3.2%。这表明即使针对同一EV样本和相同标志物，不同仪器获得的阳性比例也明显不同。

在“3.2.2 uEVs”小节中，尿液EVs显示出较LCCM-EVs更高的复杂性与异质性。三种平台均检测到小EVs及较大囊泡群体，但NanoFCM和CytoFLEX Nano主要检出<200 nm颗粒，而ZetaView Evolution覆盖更宽粒径范围，约82%颗粒<200 nm，约18%>200 nm。未染色uEVs中，ZetaView Evolution报告浓度最高，为4.96 × 10⁹ particles/mL；CytoFLEX Nano为3.06 × 10⁹ particles/mL；NanoFCM为9.59 × 10⁸ particles/mL。平均粒径分别为165 ± 148 nm、60 ± 40 nm和70 ± 19 nm，尤其ZetaView所测值明显更大。CD81染色后，ZetaView测得CD81阳性比例为6.2%，显著高于NanoFCM的0.4%和CytoFLEX Nano的0.3%；CD63染色后，ZetaView测得15.2%，NanoFCM为1.8%，CytoFLEX Nano为0.5%。这些结果进一步说明，对于复杂生物体液来源EVs，不同平台在荧光背景、非特异性信号和检测阈值上的差别会被进一步放大。

在“3.3 EV-Associated Total DNA Quantification”部分，研究人员比较了EV相关DNA定量的技术差异。

在“3.3.1 LCCM-EV-DNA”中，LCCM来源EV-DNA采用NanoDrop和Qubit两种方法检测。按LCCM输入体积归一化后，NanoDrop测得DNA为14.10 ± 7.18 ng/mL，A₂₆₀/A₂₈₀纯度比为1.79 ± 0.12；Qubit测得则仅为0.12 ± 0.04 ng/mL。结果显示两种方法所得数值差异极大，提示吸光度法可能显著高估EV相关DNA含量。

在“3.3.2 uEV-DNA”中，研究人员对4例健康供体尿液来源uEV-DNA进行了试点分析，并以尿液体积和尿肌酐（U-creatinine）进行归一化。总uEV-DNA范围为0.2–0.7 ng/mL尿液，不同供体之间存在明显波动。该结果说明，即使在健康供体中，uEV相关DNA水平也具有相当异质性。

讨论部分围绕上述平台差异的来源和意义展开。研究人员指出，EV研究当前面临的核心障碍之一，是不同分析仪器之间缺乏可重复、可比对的标准化表征体系。NanoFCM与CytoFLEX Nano属于纳米流式细胞术（nano-flow cytometry，nFCM）平台，依赖散射光强间接推断颗粒尺寸；ZetaView Evolution则属于纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）平台，通过布朗运动和Stokes-Einstein方程估算流体动力学粒径。由于二者采用不同物理模型，且EVs本身又具有膜组成复杂、表面蛋白多样、可能形成生物分子冠（biomolecular corona）的特征，因此同一样本在不同平台上的尺寸与浓度结果天然存在偏差。研究指出，ZetaView Evolution通常测得更大的粒径及更高的浓度，这与其基于扩散的检测方式能够覆盖更广颗粒范围、并更易纳入小颗粒或共分离纳米组分有关；而纳米流式平台受散射阈值限制，检测更具选择性，浓度结果相对较低。

进一步地，即使在两种纳米流式平台之间，差异仍然存在。NanoFCM通常报告更低的浓度和更小的平均粒径，而CytoFLEX Nano因具有更高功率激光及紫侧向散射通道，对小颗粒散射更敏感，但同时也可能增加复杂样本中的背景与事件率。TEM则提供了图像基础的形态学参考，能观察到部分低于约40 nm的平台检测下限颗粒，但TEM受样本制备伪影、吸附偏倚和干燥形变影响，更适合作为定性而非严格定量工具。对于CD63和CD81检测，研究认为不同平台的荧光阳性比例差异除源于光学配置外，还与荧光事件定义、背景扣除方式及样本中非囊泡组分干扰有关。尤其在uEVs中，ZetaView荧光NTA可能记录视野内所有荧光对象，因此更易受到游离抗体、抗体-染料复合物、蛋白聚集体或脂蛋白等非特异信号影响。研究还指出，染色后粒径增大可能与抗体复合物形成有关，而尿液样本采用蔗糖垫预处理后未必表现出同等程度的尺寸偏移，提示样本前处理方式同样影响后续检测表现。对于DNA定量，NanoDrop高于Qubit的结果与其无法区分双链DNA、单链DNA、RNA及其他紫外吸收污染物的固有限制一致，因而Qubit被认为在EV-DNA检测中更具可靠性。

研究结论部分可译为：EV研究领域正在持续快速发展，同时对于稳健且可重复表征方法的需求也日益增长。标准化方法对于实现研究间有意义的比较，以及推动新兴EV技术向多种诊断与治疗应用转化，具有关键意义。本研究结果结合既往报道强调，EV表征具有方法依赖性。因此，准确解读相关结果需要审慎考量各平台的局限性与能力，并采用正交方法对报告指标进行验证。

总体而言，该研究以同一批次样本跨平台平行检测为核心设计，系统展示了EV粒径、浓度、表面标志物及EV相关DNA测定结果的显著方法依赖性。其主要贡献不在于提出新的分离技术，而在于为EV领域提供了一个直接、清晰的比较框架，说明不同平台之间的结果不能简单互换，也不能脱离具体仪器特性进行横向解释。这一工作为未来建立跨平台校准体系、优化复杂生物体液中的EV分析流程、并推动MISEV框架下更高层次的方法学标准化提供了重要实证基础。