肾透明细胞癌来源细胞外囊泡通过NOD1信号通路将肿瘤相关巨噬细胞重编程为免疫抑制表型

《Journal of Extracellular Vesicles》：Tumour-Derived Extracellular Vesicles Reprogramme Tumour-Associated Macrophages Into Immunosuppressive Phenotype via NOD1 Signalling in Clear Cell Renal Cell Carcinoma

　　

摘要：肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma, ccRCC）来源细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）在髓系细胞向免疫抑制表型分化中发挥关键作用，但其潜在机制尚不清楚。研究人员通过整合单细胞核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）、EV蛋白质组学及表型验证，鉴定到模式识别受体（pattern recognition receptor, PRR）NOD1是EV驱动巨噬细胞分化的关键介质。临床上，ccRCC组织中NOD1过表达与免疫抑制性巨噬细胞浸润增加、免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）治疗耐药及不良预后相关。机制上，富集SCRIB（一种Rho GTP酶激活因子）的ccRCC-EVs通过Rho GTP酶信号触发巨噬细胞内NOD1持续活化。关键的是，NOD1信号通路汇聚于干扰素调节因子4（interferon regulatory factor 4, IRF4），其表达可能受NF-κB活化及小眼畸形相关转录因子（microphthalmia-associated transcription factor, MITF）抑制的动态调控。此外，体内实验显示抑制NOD1可增强ICIs治疗效果。研究人员的工作揭示了ccRCC中一种新的EV介导的免疫逃逸机制，并提出SCRIB–NOD1–IRF4轴可作为恢复抗肿瘤免疫的潜在治疗靶点。

论文解读：肾透明细胞癌来源细胞外囊泡通过NOD1信号重编程肿瘤相关巨噬细胞为免疫抑制表型

研究背景与立项依据

肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma, ccRCC）是最常见的肾恶性肿瘤亚型，约20%患者确诊时即为晚期，且接受局部切除者中约三分之一会复发。肿瘤浸润髓系细胞尤其是肿瘤相关巨噬细胞（tumour-associated macrophages, TAMs）被证实促进ccRCC进展、侵袭及免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）耐药，靶向髓系细胞以恢复抗肿瘤免疫是ccRCC有前景的治疗策略。ccRCC肿瘤微环境（tumour microenvironment, TME）中巨噬细胞常表现为免疫抑制功能，而促炎特征群体减少，这种向免疫抑制表型的偏移与患者不良预后相关，但ccRCC TME诱导巨噬细胞功能重编程的具体机制——特别是肿瘤细胞如何将免疫抑制信号传递给巨噬细胞驱动表型转换——尚未阐明。细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs，含外泌体和微囊泡）是TME中肿瘤细胞与其他组分通讯的重要介质，可携带生物活性分子传递给免疫 cells 影响免疫监视与逃逸，既往研究提示ccRCC来源EVs可调控巨噬细胞表型并介导治疗耐药，但EV介导巨噬细胞功能重编程的分子机制仍需深入探究。本研究旨在明确ccRCC-EVs调控巨噬细胞表型转换的关键分子及信号轴，并探讨其临床意义与治疗价值，论文发表于《Journal of Extracellular Vesicles》。

主要关键技术方法概述

研究人员整合生物信息学分析与实验验证开展工作：利用TCGA-KIRC（The Cancer Genome Atlas—Kidney Renal Clear Cell Carcinoma）数据库进行基因表达与生存关联分析；分析已发表的ccRCC及正常肾脏单细胞核RNA测序（snRNA-seq）数据并进行细胞分型与通路富集；收集新华医院196例经病理确诊的ccRCC手术切除标本及术后接受ICI治疗患者的组织，开展免疫组化（immunohistochemistry, IHC）与多色免疫荧光（multiplex immunofluorescence, mIF）检测NOD1、SCRIB及巨噬细胞标志物；从ccRCC细胞系（786O、769P）及原代ccRCC细胞、正常肾小管细胞系HK2条件培养基中通过差速离心结合超速离心分离纯化EVs，进行透射电镜（transmission electron microscopy, TEM）、纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）及Western Blot鉴定；对ccRCC-EVs进行数据非依赖采集（data independent acquisition, DIA）定量蛋白质组学分析；用PMA诱导THP-1细胞及M-CSF诱导人外周血单核细胞来源巨噬细胞（human peripheral blood monocyte-derived macrophages, hPBMs）建立巨噬细胞模型，用慢病毒构建NOD1敲除/敲低、过表达及SCRIB敲除/过表达细胞系，进行EV摄取、Western Blot及RT-qPCR检测；对NOD1敲除与野生型巨噬细胞行转录组RNA测序（RNA-seq）并结合基因集变异分析（gene set variation analysis, GSVA）及pySCENIC转录因子（transcription factor, TF）活性分析；构建小鼠皮下移植瘤模型（野生型与SCRIB敲除Renca细胞），并给予NOD1抑制剂Nodinitib-1联合抗小鼠PD-1抗体治疗，评估肿瘤生长、瘤内免疫细胞表型及分子表达变化。

研究结果

3.1 Integrated Transcriptomic Analysis Identifies NOD1 as a Potential Mediator of Macrophage Functional States in ccRCC

研究人员分析TCGA-KIRC数据库发现NOD1表达与免疫抑制巨噬细胞特征呈显著正相关，与促炎巨噬细胞特征负相关；高NOD1表达患者总生存更差。分析已发表snRNA-seq数据，将髓系细胞注释为7个亚群，按髓系细胞NOD1表达将ccRCC样本分为NOD1-high与NOD1-low组，NOD1-high组中促炎巨噬细胞（Macro_PI）与免疫抑制巨噬细胞（Macro_IIa/IIb）比值降低，提示向免疫抑制偏移；差异基因与GSVA显示NOD1-high组髓系细胞NF-κB通路改变，Macro_PI中促炎通路下调、Macro_II中抗炎通路上调。对RCC细胞群GSVA发现NOD1-high组RCC细胞Rho GTP酶活化通路显著富集，提示肿瘤细胞可能通过Rho GTP酶相关信号诱导巨噬细胞NOD1活化。结论：NOD1与ccRCC巨噬细胞免疫抑制表型相关，可能被肿瘤源Rho GTP酶信号激活。

3.2 NOD1 Upregulation in ccRCC Tissues Correlates With Immunosuppressive Macrophage Infiltration and Poor Clinical Prognosis

研究人员对196例ccRCC组织IHC显示NOD1在肿瘤组织高于癌旁，主要定位于免疫细胞；高NOD1表达患者无进展生存（progression-free survival, PFS）更差。ICI治疗患者中，治疗无应答者NOD1 IHC评分显著高于应答者。mIF显示NOD1与CD163?免疫抑制巨噬细胞共定位，NOD1-high组CD163?/CD206?/IL-10?巨噬细胞增多、CD86?/CD80?促炎巨噬细胞减少。结论：ccRCC组织NOD1高表达伴随巨噬细胞免疫抑制偏移、ICI原发耐药及不良预后，可作潜在预测标志物。

3.3 CcRCC-EVs Activate NOD1 Signalling to Promote an Immunosuppressive Phenotype in Macrophages

研究人员从ccRCC细胞系及原代ccRCC细胞、HK2细胞分离鉴定EVs（典型杯状结构、直径~70 nm、阳性标记CD9/CD63/ALIX/TSG101/Flotillin-1、阴性标记Calnexin），荧光标记示巨噬细胞可摄取ccRCC-EVs。ccRCC-EVs处理THP-1来源巨噬细胞显著升高RIP2磷酸化（p-RIP2）及NF-κB p65磷酸化（p-P65），上调IL-10、ARG1、CD163蛋白表达，早期（2 h）短暂升高促炎因子mRNA，24 h后免疫抑制因子占主导；NOD1特异性抑制剂ML130或NOD1敲除/敲低均阻断ccRCC-EVs诱导的p-RIP2/p-P65升高及IL-10/ARG1/CD163上调。结论：ccRCC-EVs通过激活NOD1→RIP2→NF-κB信号驱动巨噬细胞向免疫抑制表型转化，且依赖NOD1。

3.4 CcRCC-EVs Activate NOD1 via SCRIB-Mediated Rho GTPase Signalling

研究人员对EV-786O与EV-HK2行DIA蛋白质组学，GSVA示EV中Rho GTP酶循环/信号转导通路最显著富集；差异蛋白筛选结合临床预后关联锁定SCRIB（Rho GTP酶激活 scaffold蛋白）在ccRCC-EVs中显著高表达，而小GTP酶如CDC42无差异。临床队列IHC示肿瘤SCRIB高于癌旁、高SCRIB预后差；snRNA-seq显示RCC细胞SCRIB表达与Macro_II比例正相关。Western Blot确认SCRIB富集于ccRCC-EVs。结论：ccRCC-EVs通过递送SCRIB激活巨噬细胞Rho GTP酶信号进而活化NOD1。

3.5 SCRIB is Essential for ccRCC-EV-Mediated NOD1 Activation in Macrophages

研究人员构建SCRIB敲除（SCRIB-KO）786O/769P细胞，其来源EVs无SCRIB蛋白；用SCRIB-KO EVs处理巨噬细胞，p-RIP2/p-P65及IL-10/ARG1/CD163上调被显著削弱；用SCRIB过表达巨噬细胞加SCRIB-KO EVs处理可回补NOD1活化及免疫抑制标志物升高。结论：SCRIB是ccRCC-EVs激活巨噬细胞NOD1及诱导免疫抑制表型不可或缺的成分。

3.6 NOD1 Activation by ccRCC-EVs Induces an Immunosuppressive Phenotype in Macrophages via IRF4

研究人员对NOD1-KO与野生型巨噬细胞行RNA-seq，GSVA确认NOD1活化主要增强TAK1复合体及NF-κB活性，自噬与线粒体途径无明显变化。差异表达与TF活性分析发现NOD1-KO细胞中干扰素调节因子4（IRF4）活性及蛋白水平显著下调，IRF5/IRF7无变化；NOD1过表达升高IRF4，敲除则降低。NOD1-KO细胞中IL-10/ARG1/CD163随IRF4降低而下降。机制探究示NOD1活化伴随NF-κB活化及小眼畸形相关转录因子（MITF，IRF4转录抑制因子）蛋白水平降低，JAK-STAT6通路无明显主导变化。结论：ccRCC-EVs激活NOD1通过NF-κB活化联合MITF抑制上调IRF4，IRF4介导巨噬细胞获得免疫抑制表型。

3.7 Targeting the SCRIB-NOD1 Axis in Vivo Suppresses Tumour Growth and Enhances Anti-PD-1 Efficacy

研究人员皮下接种SCRIB-KO与野生型Renca细胞建立小鼠模型，SCRIB-KO组肿瘤生长减慢，瘤内Cd86?巨噬细胞增多、Cd163?及PD-1?CD8? T细胞（ exhausted CD8? T cells）减少，p-RIP2与IRF4降低。进一步在Renca移植瘤中比较抗PD-1单药与抗PD-1联合NOD1抑制剂Nodinitib-1治疗，联合组肿瘤生长受抑更显著，瘤内Cd163?巨噬细胞及CD8? T细胞耗竭减少、Cd86?巨噬细胞增加。结论：敲除肿瘤SCRIB或抑制NOD1可阻断EV-SCRIB-NOD1-IRF4轴、逆转巨噬细胞免疫抑制、改善抗肿瘤免疫并增敏ICI疗效。

讨论与结论翻译

研究人员讨论指出，EVs作为细胞间信使在肿瘤免疫逃逸中作用广泛但机制复杂，本研究首次揭示NOD1被ccRCC-EVs激活并驱动TAM免疫抑制重编程。不同于结直肠癌等微生物相关肿瘤中NOD1被病原体配体激活并可能促炎，ccRCC中肿瘤源EVs致NOD1持续活化，产生时间依赖性表型偏移（早期短暂促炎→持续免疫抑制），被肿瘤劫持建立慢性免疫抑制微环境。EV蛋白质组鉴定SCRIB为关键NOD1激活 cargo，SCRIB通过支架作用协调Rho家族GEF/GAP调控Rho GTP酶进而激活NOD1，EV中CDC42无差异说明ccRCC具特有机制，SCRIB是主导但不排除其他EV成分（如RNA）微弱贡献。IRF4是NOD1下游关键TF，受NF-κB上调及MITF抑制共同调控，具体NOD1→IRF4精确分子互作需进一步研究。研究局限性在于未完全解析SCRIB与NOD1直接作用细节及MITF-NOD1关系。综上，研究人员得出结论：ccRCC来源EVs包裹的SCRIB转运至巨噬细胞，经Rho GTP酶信号激活NOD1，持续NOD1活化上调IRF4转录活性，驱动巨噬细胞重编程为免疫抑制表型，与ccRCC不良预后相关；靶向NOD1可与ICI联用增效，SCRIB–NOD1–IRF4轴是恢复抗肿瘤免疫的新潜在治疗靶点。