绿藻中的生长素响应和PIN介导的运输

《Journal of Integrative Plant Biology》：Auxin response and PIN-mediated transport in chlorophyte algae

　　

生长素（主要为吲哚-3-乙酸，IAA）是陆地植物生长和发育的核心调节因子，但其在绿藻中的生理作用尚不清楚。研究人员在此表明，外源IAA以浓度依赖性方式调节Chlorella sorokiniana、Chlorella variabilis和Chlamydomonas reinhardtii的生长。低浓度IAA通过加速细胞分裂起始而不影响细胞大小来促进生长，而较高浓度则抑制增殖。放射示踪实验显示，这三个物种通过被动扩散和能量依赖、可饱和过程的组合，跨质膜摄取和释放IAA。过量未标记天然和合成生长素的竞争进一步支持了具有广泛底物识别的载体介导运输的存在。系统发育分析在绿藻和其他非植物真核生物中鉴定了潜在的PIN样生长素外排蛋白，结构模型支持整体PIN折叠的保守性和预测的生长素结合残基。然而，在Xenopus laevis卵母细胞、烟草BY-2培养细胞和Arabidopsis thaliana中的功能实验不支持这些蛋白在定向生长素外排中的作用。相反，非植物PIN同源物主要定位于内质网，并在异源系统中表现出有限或没有转运活性。总之，这些发现表明，生长素响应性和基础细胞生长素运输早于典型的PIN介导的定向生长素外排，后者似乎是链型植物谱系的后期创新。

### 论文解读

#### 研究背景与问题

植物从水生环境向陆地环境的过渡发生在链型藻类中，伴随一系列发育创新，奠定了复杂植物体构建和适应性生长策略的基础。植物激素生长素（主要是吲哚-3-乙酸，IAA）通过局部生物合成和严格调控的定向运输来协调植物发育，形成局部的生长素最大值和浓度梯度，对形态建成和环境响应至关重要。在陆地植物中，PIN家族生长素转运蛋白介导定向的细胞间生长素运输，但在藻类中，生长素的作用和PIN的功能起源仍不清楚。尽管在绿藻如Chlorella vulgaris和Chlamydomonas reinhardtii中检测到了IAA，且外源IAA能引起生理响应，但绿藻是否具备类似陆地植物的PIN介导的定向运输系统一直存在争议。此前在丝状链型藻类Klebsormidium flaccidum中发现功能性PIN介导的运输先于陆地植物进化，但在更早分支的谱系中，PIN同源物的功能和进化起源尚未明确。因此，本研究旨在探究绿藻如何响应生长素，以及来自绿藻和非植物谱系的PIN样蛋白是否具有生长素转运功能。

#### 研究内容与结论

研究人员通过生理实验、放射示踪法、系统发育与结构分析、异源表达系统等多种方法，结合绿藻（C. sorokiniana、C. variabilis、C. reinhardtii）、硅藻（Fistulifera solaris）、原生生物（Trichomonas vaginalis）和真菌（Gonopodya prolifera）的PIN同源物，系统评估了这些蛋白的转运活性。结果表明，绿藻对IAA具有浓度依赖性响应，低浓度促进生长，高浓度抑制增殖，这种效应主要通过调节细胞分裂起始时间而非细胞大小实现。放射示踪实验显示，绿藻通过被动扩散和能量依赖的载体介导过程摄取和释放IAA，且该转运系统可被过量未标记IAA和合成生长素萘乙酸（NAA）竞争抑制，提示存在可饱和的、底物识别广泛的载体。系统发育分析发现，绿藻PIN同源物（CsPIN、CvPIN）与硅藻、原生生物和真菌的序列聚为一个独立支系（Group 13），与陆地植物典型PINs明显分开。这些PIN同源物在mRNA水平表达且保留了核心跨膜拓扑结构，但分子对接预测其与IAA的结合能力较弱（结合能-5.4至-6.7 kcal mol^?1）。异源表达实验显示，在非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞中，这些非植物PINs（CsPIN、CvPIN、FsPIN、GpPIN）无论是否与蛋白激酶PINOID（PID）共表达，均未检测到明显的IAA外排活性；在烟草BY-2培养细胞中，它们主要定位于内质网（ER），仅CvPIN表达导致细胞内放射性标记载体[³H]-NAA积累增加（提示增强的滞留），FsPIN和GpPIN无显著活性。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，这些非植物PINs的异源表达不影响生长素依赖的根系毛发生长和叶脉发育，也无法互补pin2突变体的向地性缺陷。这些结果共同表明，绿藻具有生长素响应和基础运输能力，但非链型植物PIN同源物不介导典型的定向生长素外排，而是可能参与内质网相关过程（如细胞内稳态）。

#### 技术方法

本研究采用以下关键技术：（1）生理响应分析：不同浓度IAA处理绿藻，结合自动细胞计数和微流控活细胞成像（Tulip芯片），监测细胞密度、分裂时间和大小变化。（2）放射示踪法：使用[³H]-IAA进行摄取和外排实验，结合竞争实验（过量未标记IAA和NAA）和ATP耗竭处理（叠氮化钠），评估被动扩散与载体介导运输贡献。（3）系统发育与结构分析：基于HMMER搜索和USEARCH去冗余，构建最大似然系统发育树（21个物种），使用AlphaFold2预测蛋白结构并进行分子对接（AutoDock Vina）和结构叠加（PyMOL），评估与拟南芥PIN8的结构保守性和IAA结合能力。（4）异源表达系统：在非洲爪蟾卵母细胞、烟草BY-2细胞（Estradiol诱导XVE系统）和拟南芥（35S或PIN2启动子驱动）中表达GFP标记的非植物PINs，通过共聚焦显微镜定位和放射性积累测定功能。

#### 研究结果

**生长素以浓度依赖性方式调节绿藻细胞增殖**
通过细胞计数和活细胞成像发现：1 μM IAA显著增加C. sorokiniana、C. variabilis和C. reinhardtii的细胞数并提前分裂起始时间（中位数8.4 h vs 9.2 h），但细胞大小不变；50 μM IAA完全抑制分裂（630 min内无分裂事件）；10 μM IAA无显著影响。OD₇₅₀生物量测定结果一致。

**衣藻和绿藻中存在主动与被动生长素输入和输出**
放射示踪表明三个物种均能摄取和释放[³H]-IAA。竞争实验显示过量未标记IAA（500 nM与10 μM）和NAA均显著降低[³H]-IAA通量，提示存在可饱和转运体。叠氮化钠处理（ATP耗竭）后，摄取和释放均降低约50%，且残留被动扩散成分；同时荧光素二乙酸酯（FDA）染色显示代谢活性显著下降。时间过程实验证实10 min内IAA积累达平台期。

**PIN同源物的系统发育关系、表达和基因结构**
系统发育树（21个物种）中共14个支系，非植物PINs（绿藻CsPIN、CvPIN，硅藻FsPIN，原生生物，真菌GpPIN）组成Group 13（bootstrap 100），与短PINs（PIN5/6/8）和植物典型PINs分开。RT-qPCR显示CsPIN和CvPIN在指数期低水平表达，且呈单峰熔解曲线。所有非植物PINs保留N端与C端跨膜结构域，但中央亲水环较短。

**分子对接预测非植物PINs结合IAA，但卵母细胞中无转运活性**
基于拟南芥PIN8结构，关键结合残基在FsPIN和GpPIN中保守。AlphaFold2结构模型与IAA的分子对接显示结合能：FsPIN -6.7、GpPIN -6.5、CvPIN -5.9、CsPIN -5.4 kcal mol^?1。结构叠加Cα RMSD 3.15–4.57 ?（154–314残基）。然而，在非洲爪蟾卵母细胞中，无论是否共表达PID激酶，所有非植物PINs均未介导可检测的[³H]-IAA外排（与AtPIN1对照形成对比）。

**非植物PINs在BY-2细胞中显示内质网定位和有限生长素转运**
在烟草BY-2细胞中，XVE诱导的CvPIN-GFP、GpPIN-GFP和FsPIN-GFP主要在间期细胞的内质网（ER）定位，分裂期出现于细胞板，质膜信号弱或无。ER标记mCherry-HDEL共定位确认。放射性[³H]-NAA积累实验：CvPIN表达导致积累增加（增强滞留），FsPIN无变化，GpPIN微弱减少（提示极弱外排）。CsPIN未能获得稳定转化系。

**非植物PINs不影响拟南芥生长素介导的发育**
在拟南芥Col-0背景下组成型表达35S::PINs（CsPIN、CvPIN、FsPIN、GpPIN）的转基因株系中，根毛长度、密度和子叶叶脉模式与野生型无显著差异。在pin2突变体背景下，pPIN2驱动的非植物PINs未能恢复向地性缺陷（弯曲角度随机），而对照pPIN2::AtPIN2完全恢复。共聚焦显示这些蛋白同时定位于质膜和内质网，呈现混合定位。

#### 讨论与结论

讨论指出，绿藻对生长素的响应早于PIN依赖的定向运输能力。绿藻中生长素运输依赖被动扩散和能量依赖的载体，但载体分子身份未知，可能不同于陆地植物的PIN和AUX1/LAX。非植物PINs主要定位于内质网，功能可能限于细胞内生长素处理（如区室化或稳态），而非定向外排。结构上虽保留PIN折叠和结合位点，但转运活性缺失，提示功能分化。进化上，生长素感知和基础运输先于链型植物谱系中极向运输的出现，PIN定向运输是链型植物谱系的后期创新。该研究发表于《Journal of Integrative Plant Biology》。**研究结论**：绿藻具有生长素响应性和基础细胞运输能力，但非链型植物PIN同源物不介导定向生长素外排；典型的PIN介导的定向生长素运输是链型植物谱系的后期进化创新。