CLEC14A与肝细胞癌中中性粒细胞浸润相关，并介导中性粒细胞穿过肝内皮细胞的募集

《The Journal of Pathology》：CLEC14A correlates with neutrophil infiltration in hepatocellular carcinoma and mediates neutrophil recruitment across liver endothelial cells

　　

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因，预计未来几年病例数将急剧增加。克服肝细胞癌（HCC）中的免疫微环境仍然是一个挑战，而肿瘤相关中性粒细胞等先天免疫群体可能损害免疫治疗的成功。阐明中性粒细胞穿过肝内皮的募集机制可能为提升免疫治疗效果提供新途径。CLEC14A是一种内皮特异性受体，调节萌芽血管生成，在低剪切环境中上调。研究人员发现CLEC14A在肝细胞癌（HCC）血管和急性肝损伤期间的脉管系统中均高表达，这使研究人员假设CLEC14A可能调控中性粒细胞向肝脏和肝细胞癌（HCC）的募集。研究人员发现，在公开数据集和手术切除的肝细胞癌（HCC）组织中，CLEC14A与中性粒细胞特征和浸润呈正相关。对CLEC14A^high和CLEC14A^low表达肿瘤的空间转录组学（spatial transcriptomics，ST）分析证实了CLEC14A^high肿瘤中髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）的上调，以及与其他剪切依赖性标志物的相关性，但与血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）呈负相关。为了巩固相关性研究，研究人员探讨了CLEC14A在中性粒细胞穿过肝内皮募集中的作用。研究人员利用基于流动的人肝内皮检测和中性粒细胞募集的体内模型进行了体外募集研究。通过使用CLEC14A的siRNA敲低和特异性阻断抗体，研究人员发现CLEC14A敲低阻断了中性粒细胞与肝内皮的牢固粘附，但这与其已知配体MMRN2的相互作用无关。最后，研究人员确认，在缺血-再灌注肝损伤模型中，Clec14a缺陷导致中性粒细胞穿过肝窦的募集显著减少。研究人员揭示了血管生成受体CLEC14A与中性粒细胞募集之间的联系。靶向肿瘤内皮上的CLEC14A可能是调控肝细胞癌（HCC）中中性粒细胞浸润的新方法。? 2026 作者。The Journal of Pathology 由 John Wiley & Sons Ltd 代表英国及爱尔兰病理学会出版。

**研究背景与目的**
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球癌症死亡的主要原因，预计到2025年全球将有100万人受原发性肝癌影响。近年来，免疫治疗联合抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）治疗的突破性进展表明，靶向血管以调控免疫微环境具有巨大潜力。然而，当前仅约30%的晚期HCC患者对此联合疗法产生响应，因此寻找独立于VEGF的新型血管靶点以塑造HCC免疫微环境至关重要。中性粒细胞在肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中扮演活跃角色，可与适应性免疫系统相互作用并在包括HCC在内的实体瘤模型中介导抗肿瘤T细胞反应。识别调控中性粒细胞向HCC TME募集的因子具有重要治疗意义。循环中的中性粒细胞通过与血管内皮的相互作用被引导至损伤部位，这是中性粒细胞反应的关键起始事件。在肝脏中，白细胞募集发生在肝窦的低流道中，肝窦由表型独特的肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells，LSECs）衬覆。肿瘤血管床也以低剪切流为特征，可能与肝窦通道共享募集特征。基于此，研究人员聚焦于C型凝集素家族成员CLEC14A，该分子在肿瘤内皮上显著上调，其表达受剪切依赖性调控，低剪切促进内皮表达。本研究旨在探究CLEC14A是否调控中性粒细胞向肝脏和HCC的募集，并揭示其作用机制。
**研究内容与结论**
研究人员通过分析公开转录组数据集（HEPTROMIC队列 n=228 和癌症基因组图谱（TCGA）HCC队列 n=361）、手术切除的HCC组织（n=15）及空间转录组学（spatial transcriptomics，ST），发现CLEC14A表达与中性粒细胞特征和浸润呈正相关。在体外层面，利用原代人肝窦内皮细胞（LSECs）进行静态粘附、流动粘附及跨内皮迁移实验，并结合siRNA敲低和特异性阻断抗体，发现CLEC14A敲低显著抑制中性粒细胞在低剪切力下的牢固粘附（但不影响跨内皮迁移），且该作用独立于其与MMRN2的相互作用。机制上，重组CLEC14A-Fc可直接结合中性粒细胞，且该结合依赖于其肝素结合结构域（R161位点）。在体内，利用Clec14a基因敲除（KO）小鼠的肝脏缺血-再灌注损伤模型，证实Clec14a缺失显著减少肝窦内中性粒细胞的募集。本研究首次揭示了血管生成受体CLEC14A与中性粒细胞募集之间的直接联系，为靶向肿瘤内皮调控HCC免疫微环境提供了新策略。论文发表在《The Journal of Pathology》。
**主要关键技术方法**
（1）样本队列：人肝组织来源于伯明翰伊丽莎白女王医院肝移植患者及健康供肝（伦理号06/Q2702/61、18/WA/0214、18/LO/0102），外周血来自健康志愿者（伦理号18/WA/0214）；HCC手术标本来自人类生物材料资源中心（伦理号25/NW/0013）；活检样本收集于IRAS 266624。动物实验遵循英国内政部许可证。（2）原代人LSEC分离与培养：从肝移植或手术切除组织中分离LSECs，培养于含10%人血清、VEGF和HGF的无血清内皮培养基。（3）RNA干扰：使用两种靶向CLEC14A的siRNA（Thermo Fisher）转染LSECs，48h后通过western blot验证敲低效率。（4）中性粒细胞粘附实验：静态粘附实验使用TNFα刺激的LSECs单层；流动粘附实验在Ibidi μ-slide VI通道内进行，剪切应力0.05 Pa模拟肝窦低流环境，实时相差显微镜观察粘附与跨内皮迁移。（5）体内模型：8周龄Clec14a KO小鼠及野生型对照行肝脏缺血-再灌注损伤，随后通过活体显微镜（intravital microscopy）定量肝窦内中性粒细胞募集（抗GR-1抗体标记）。（6）空间转录组学：使用NanoString GeoMx数字空间剖析（digital spatial profiling，DSP）对CLEC14A^high（n=4）和CLEC14A^low（n=6）HCC肿瘤切片进行RNA分析，选择肿瘤、肿瘤周围及非肿瘤区域为感兴趣区（ROIs）。（7）公共数据集分析：采用单样本基因集富集分析（ssGSEA）评估HEPTROMIC和TCGA数据集中中性粒细胞转录特征（Bindea et al.）与CLEC14A表达的相关性（Spearman秩相关）。（8）重组蛋白结合实验：流式细胞术检测荧光标记的CLEC14A-ECD-Fc与中性粒细胞及淋巴细胞的结合，使用肝素结合突变体（R161A）明确结合位点。
**研究结果**
**1. 急性及慢性炎症性肝病中CLEC14A表达上调**
通过免疫组织化学分析，健康人肝组织主要血管和肝窦中CLEC14A表达低水平；在急性肝损伤（酒精性肝炎、血清阴性肝炎）和慢性炎症性肝病（酒精性肝病）的肝窦血管中显著上调；在肝细胞癌（HCC）肿瘤血管（包括肿瘤肝窦血管和肿瘤周围血管）中同样高表达。表明在多种炎症和恶性过程中，肝内皮CLEC14A表达显著上调。
**2. 肿瘤血管中CLEC14A表达与HCC中中性粒细胞特征及浸润相关**
在HEPTROMIC（n=228）和TCGA（n=361）数据集中，CLEC14A mRNA表达与中性粒细胞转录特征（Bindea特征）呈显著正相关（Spearman秩相关）。在15例手术切除HCC组织的连续切片中，CLEC14A免疫组化阳性面积百分比与CD15⁺中性粒细胞免疫荧光阳性面积百分比呈正相关（Spearman秩相关）。对新鲜活检HCC组织的分析排除了手术操作的影响。空间转录组学（ST）分析显示，CLEC14A^high肿瘤内CLEC14A转录本从中心到周边呈梯度表达（中心最高）。差异表达分析发现CLEC14A^high肿瘤中165个基因上调（包括ROBO4、CD34、THBD、CBL和中性粒细胞特异性基因髓过氧化物酶（MPO）），142个基因下调。KEGG通路富集分析显示CLEC14A^high肿瘤中上调的途径包括MAPK通路和Th17细胞分化等中性粒细胞活化相关通路。细胞粘附分子分析显示CLEC14A^high肿瘤中整合素β2（ITGB2）、HLA分子、CD34和PD-1表达升高。在肿瘤周围区域，CLEC14A^high肿瘤中差异表达基因较少，但观察到TNF信号通路和MAPK信号通路上调，以及ITGB2、PDCD1、CD8和ICAM2的上调。此外，在肿瘤区域内，CLEC14A表达与大多数血管生成基因（36个中的24个）呈正相关，但与VEGFA呈负相关。
**3. CLEC14A在原代人肝窦内皮细胞（LSECs）中表达并介导其血管生成特性**
从健康及肝硬化肝脏中分离的原代LSECs经Western blot检测，CLEC14A以与MMRN2结合（250 kDa）和未结合（100 kDa）两种状态存在，且肝硬化肝脏中CLEC14A表达高于健康肝脏。实时定量PCR显示，低剪切应力和缺氧（2% O₂）均上调CLEC14A mRNA表达，而MMRN2表达趋势相反。Matrigel实验表明，siRNA敲低CLEC14A在6小时显著减少LSECs的管状形成（趋势性减少在12小时不显著）。
**4. CLEC14A在低剪切力下介导中性粒细胞粘附于LSECs，该作用独立于CLEC14A/MMRN2相互作用**
静态粘附实验显示，经高剪切应力预处理的LSECs（已知下调CLEC14A）显著减少中性粒细胞粘附；CLEC14A siRNA敲低同样显著减少中性粒细胞粘附。流动粘附实验（0.05 Pa模拟肝窦）中，CLEC14A敲低显著减少中性粒细胞的牢固粘附步骤（未影响跨内皮迁移步骤）。使用两种阻断CLEC14A与MMRN2相互作用的单克隆抗体（CRT 4和5）未改变中性粒细胞募集，表明该作用独立于CLEC14A/MMRN2互作。流式细胞术显示重组CLEC14A-Fc（而非人Fc）直接结合外周血中性粒细胞（不结合淋巴细胞）。用肝素结合突变体（R161A）替代野生型CLEC14A后，其中性粒细胞结合能力显著降低，表明CLEC14A的肝素结合结构域介导了与中性粒细胞的直接互作。
**5. Clec14a基因敲除减少急性肝损伤模型中的中性粒细胞募集**
在Clec14a KO小鼠肝脏缺血-再灌注（IR）损伤模型中，通过活体显微镜量化肝窦内中性粒细胞募集。与野生型（WT）小鼠相比，Clec14a KO小鼠在再灌注后肝窦内中性粒细胞数量显著减少（每视野细胞数及曲线下面积均显著降低），而假手术组未见明显募集。该体内结果与前人体外研究一致。
**讨论与结论**
近年来，免疫检查点治疗联合VEGF阻断改变了HCC治疗格局，靶向内皮细胞以塑造TME中白细胞浸润和活化成为热点。本研究通过公开数据集和ST分析确认CLEC14A^high肿瘤具有更强的中性粒细胞特征，且CLEC14A在肿瘤中心转录本最高（可能与中心灌注减少和血流停滞有关）。通路分析显示CLEC14A^high肿瘤呈现更强的促炎特征，且与多种低剪切力上调的血管生成基因（如ROBO4、DLL4、TIE1）正相关，但与VEGFA负相关，提示CLEC14A可能作为VEGF-A低表达肿瘤的生物标志物或替代治疗靶点。功能研究证实，CLEC14A通过其肝素结合域直接结合中性粒细胞，并在低剪切力下促进其与肝内皮的牢固粘附（而非跨内皮迁移），该作用独立于其与MMRN2的互作。体内模型进一步支持CLEC14A在肝窦中性粒细胞募集中不可或缺的角色。研究的局限性在于未探讨CLEC14A对中性粒细胞表型（如异质性和可塑性）的影响，这将是未来方向。结论：研究人员揭示了血管生成受体CLEC14A与中性粒细胞募集之间的直接联系，靶向肿瘤内皮上的CLEC14A可能是调控HCC中中性粒细胞浸润的新方法。