《The Journal of Pathology》：Aberrant alternative splicing of purinergic receptor P2RX4 prevents sensitivity towards combinatorial treatment in colorectal and pancreatic cancer
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最近，研究人员提出将化疗与P2RX4抑制联合作为表达P2RX4的上皮肿瘤的一种有前景的新型治疗方法，以预防旁分泌耐药。在此，研究人员旨在评估确定结直肠癌和胰腺癌患者的P2RX4表达状态是否能够对潜在应答患者进行分层。因此，通过RNA测序（RNA-seq）和免疫
最近，研究人员提出将化疗与P2RX4抑制联合作为表达P2RX4的上皮肿瘤的一种有前景的新型治疗方法，以预防旁分泌耐药。在此，研究人员旨在评估确定结直肠癌和胰腺癌患者的P2RX4表达状态是否能够对潜在应答患者进行分层。因此，通过RNA测序（RNA-seq）和免疫组织化学（IHC）测定P2RX4表达水平。在HeLa细胞和患者来源肿瘤类器官（PDTOs）中分析P2RX4亚型的亚细胞定位。与其RNA表达谱相反，P2RX4蛋白水平在人结直肠癌和胰腺癌上皮中由于可变剪接而表现出差异性调控。患者间异质性在结直肠癌中大于胰腺癌。值得注意的是，这些表达变异与患者总生存期无关。替代性P2RX4转录本产生了功能不同的蛋白质亚型，这些亚型在亚细胞定位和总蛋白丰度上存在差异。只有正确剪接的经典P2RX4亚型定位于质膜，并能够介导下游信号传导。相应地，仅在表达经典P2RX4转录本的患者来源肿瘤类器官中，P2RX4抑制联合化疗才有效。总之，对P2RX4表达的免疫组织化学评估（而非转录组评估）能够预测对联合治疗的敏感性，并有助于识别可能在化疗期间从P2RX4抑制中获益的患者。鉴于胰腺癌中观察到的较低异质性，该肿瘤实体可能代表化疗联合P2RX4抑制的早期临床评估的有前景候选者。? 2026 作者。《病理学杂志》由John Wiley & Sons Ltd代表大不列颠及爱尔兰病理学会出版。
**论文解读：P2RX4异常可变剪接阻碍结直肠癌和胰腺癌联合治疗敏感性**
**研究背景与目的**
化疗耐药是晚期癌症治疗面临的主要挑战，其中非遗传性、瞬时的转录适应机制日益受关注。先前研究发现，化疗诱导的肿瘤细胞死亡会释放活性氧（ROS）和细胞外三磷酸腺苷（ATP），ATP通过激活嘌呤能受体P2RX4（P2RX4）及下游mTOR信号启动促存活程序，而ROS则触发促凋亡信号，两者平衡决定存活与否。因此，联合P2RX4抑制与化疗可能成为克服旁分泌耐药的策略。然而，P2RX4在不同患者中的表达异质性是否影响疗效尚不清楚。本研究旨在评估P2RX4表达状态能否作为结直肠癌（CRC）和胰腺导管腺癌（PDAC）患者的分层标志，以筛选可能从联合治疗中获益的人群。论文发表在《The Journal of Pathology》。
**研究内容与结论**
研究人员通过分析TCGA数据库及临床组织样本，发现P2RX4 mRNA表达水平在各亚型间差异不显著，但免疫组织化学（IHC）显示蛋白表达存在明显患者间变异，且蛋白水平与生存无关。进一步利用患者来源肿瘤类器官（PDTOs）和激光捕获显微切割的PDAC样本，发现P2RX4蛋白表达差异源于可变剪接，仅有经典剪接亚型（388氨基酸）能正确定位于质膜并介导信号，而非经典亚型（404aa、361aa、341aa、145aa）滞留在细胞质中，易被蛋白酶体和自噬途径降解。在PDTOs中，仅表达经典P2RX4的类器官对5-氟尿嘧啶（5-FU）联合P2RX4抑制剂BAY-1797敏感，而表达非经典亚型者无反应。因此，IHC检测P2RX4蛋白（而非RNA）可预测联合治疗敏感性，且PDAC因异质性较低而更具临床试验潜力。
**主要技术方法**
研究主要采用以下关键方法：通过分析TCGA（COAD和PAAD队列）及法兰克福大学医院生物库的CRC（n=278）和PDAC（n=100）组织微阵列进行RNA测序与IHC；利用HeLa细胞和敲除内源性P2RX4的HEK293T细胞转染P2RX4–SNAP-tag融合蛋白构建体，结合共聚焦显微镜与蛋白质印迹分析亚细胞定位与降解机制；在4株CRC患者来源类器官（PDTOs）中，通过免疫荧光和3D光片显微镜验证膜定位，并用5-FU与BAY-1797处理评估治疗反应。
**研究结果**
**P2RX4在人CRC和PDAC中的表达**
通过分析TCGA数据，P2RX4基因表达在CRC各共识分子亚型（CMS）及PDAC经典/基底样亚型间无显著差异。但IHC染色显示蛋白表达存在显著异质性：22%的CRC和39%的PDAC呈高表达，28%的CRC和15%的PDAC完全缺失。蛋白表达与总生存期无关，但原发灶与转移灶间表达高度一致（65%患者一致），提示单个活检标本即可分层。
**P2RX4在结直肠类器官和胰腺癌上皮细胞中发生可变剪接**
使用Ensembl和NCBI RefSeq数据库分析30个CRC PDTOs的RNA-seq数据，发现77%的类器官表达非经典P2RX4转录本（如404aa、361aa、145aa/341aa亚型）。在65个激光捕获显微切割的PDAC样本中，非经典亚型占比更高（61%），而经典亚型仅占39%。CRC经典亚型组中TP53和SMAD4突变有增多趋势，基因集富集分析（GSEA）显示p53、ROS、DNA修复及IL6-JAK-STAT3通路上调，G2M检查点和有丝分裂纺锤体通路下调。
**亚型特异性P2X4–SNAP-tag融合蛋白的定位与丰度差异**
将P2RX4各亚型（388aa、404aa、361aa、341aa）与C端SNAP-tag融合后转入HeLa细胞，仅经典388aa亚型定位于质膜，其他非经典亚型均滞留于内质网、溶酶体和线粒体，且不进入EEA1阳性早期内体。蛋白质印迹显示非经典亚型蛋白丰度显著低于经典亚型，而蛋白酶体抑制剂MG-132和自噬抑制剂巴弗洛霉素A1可提高非经典亚型蛋白水平，证实其被降解。
**经典P2RX4表达预测联合化疗的疗效**
选取表达经典P2RX4的类器官线O1/O2和表达非经典亚型的O3（无蛋白编码转录本）/O4（编码非经典亚型）进行验证。共聚焦显微镜显示O1/O2的P2RX4与EPCAM（质膜标志）共定位，而O4呈核周分布，O3无信号。在5-FU联合BAY-1797处理下，O1/O2类器官的存活率和再植能力显著降低，而O3/O4无此效应，表明仅经典P2RX4介导的膜定位是联合治疗有效的前提。
**讨论与结论**
研究表明，P2RX4可变剪接是调控其蛋白表达的关键机制，且可能源于肿瘤发生过程中剪接体全局改变导致的旁观者事件。尽管蛋白表达与预后无关，但IHC可有效识别对联合治疗敏感的患者。鉴于PDAC中P2RX4高表达比例高、病灶间异质性低，且临床对针对非遗传耐药的疗法需求迫切，该研究提出PDAC是未来P2RX4靶向临床试验的理想癌种。研究结论翻译如下：总体而言，研究人员将P2RX4转录本的异常剪接确定为PDAC和CRC中P2RX4蛋白表达的重要调控因素，可能使大部分患者对P2RX4靶向治疗策略产生耐药。因此，建议未来探索化疗联合P2RX4阻断以克服细胞死亡诱导的化疗耐药的临床试验，应基于单个患者活检的免疫组织化学分析，聚焦于P2RX4高表达肿瘤。此外，鉴于P2RX4高表达肿瘤比例高、病灶间异质性低，以及针对非遗传化疗耐药治疗的高度未满足需求，研究人员认为PDAC是未来P2RX4靶向临床试验的有前景实体。
