《Journal of Peptide Science》：Radiolabeled Angiopep-2 Peptide Vector as a Preclinical Platform for Blood–Brain Barrier Targeting: Synthesis, Radiolabeling, and Preliminary In Vivo Biodistribution in Mice
编辑推荐：
摘要：脑肿瘤治疗受限于血脑屏障（Blood–Brain Barrier，BBB），其限制大多数治疗药物进入脑实质。能够穿越BBB的多肽为诊断与治疗载荷的递送提供了有前景的策略。Angiopep-2（AP-2）是已被确认的BBB穿透载体，但基于该载体的新型放射性
摘要：脑肿瘤治疗受限于血脑屏障（Blood–Brain Barrier，BBB），其限制大多数治疗药物进入脑实质。能够穿越BBB的多肽为诊断与治疗载荷的递送提供了有前景的策略。Angiopep-2（AP-2）是已被确认的BBB穿透载体，但基于该载体的新型放射性偶联物仍有研究价值。研究人员报道了DOTA-Angiopep-2的合成及其与镥-177（177Lu）和铽-161（161Tb）的放射性标记与评价。177Lu为β?及γ发射体，161Tb为俄歇（Auger）电子及β?发射体；两者均用于靶向放射治疗和单光子发射计算机断层扫描（Single Photon Emission Computed Tomography，SPECT）成像。多肽通过固相多肽合成（Solid-Phase Peptide Synthesis，SPPS）制备。T98胶质母细胞瘤细胞的细胞毒性实验显示Angiopep-2耐受性良好，20?μM时细胞活力约100%，至100?μM时呈中度下降。放射性标记产率＞95%，室温下放射化学纯度稳定达10天，在人血清中存在中等稳定性。健康CFW小鼠生物分布显示注射后（post injection，p.i.）5分钟脑关联放射性为0.24%±0.05%注射剂量每克组织（% Injected Activity per gram of tissue，%IA/g），脑/血比值由5分钟时的0.028升至60分钟时的0.339（升高12倍）。上述结果支持DOTA-Angiopep-2可作为放射性核素递送的多功能平台，是有潜力的胶质瘤靶向研究候选分子。荷瘤模型中的进一步研究正在进行中，以评价治疗效果及转化潜力。
论文解读：放射性标记Angiopep-2多肽载体作为血脑屏障靶向的临床前平台研究
一、研究背景与立题依据
中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）疾病特别是脑胶质瘤的治疗与影像诊断受限于血脑屏障（Blood–Brain Barrier，BBB）的高选择性屏障作用，绝大多数小分子药物、大分子治疗剂及影像学造影剂无法有效穿透BBB进入脑实质。此外，胶质瘤肿瘤微环境（Tumor Microenvironment，TME）具高间质压、致密细胞外基质及免疫抑制特征，进一步阻碍药物在瘤内的蓄积与摄取。受体介导跨胞转运（Receptor-Mediated Transcytosis，RMT）是克服BBB、实现CNS靶向递送的重要策略。Angiopep-2（AP-2，十九肽序列TFFYGGSRGKRNNFKTEEY）源自抑蛋白酶肽（aprotinin），可通过与BBB内皮细胞及胶质瘤细胞表面高表达的低密度脂蛋白受体相关蛋白1（Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein 1，LRP1）结合，经RMT方式穿越BBB并被胶质瘤细胞摄取，已有AP-2偶联紫杉醇（ANG1005）进入临床试验的先例。既往AP-2的放射性标记多采用125I标记，易在体内发生脱碘而致信号丢失；而近年放射性金属（radiometal）配合大环螯合剂如1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid，DOTA）可实现残留化（residualizing）效应——即肽段被溶酶体降解后放射性金属仍滞留于细胞内，延长细胞内驻留时间并提高诊疗效率。治疗中常用的177Lu发射β?粒子（治疗）与γ光子（SPECT成像），半衰期6.7天；新兴的161Tb除发射β?粒子与γ光子外，还共发射大量俄歇（Auger）电子及内转换电子，具更高线性能量传递（Linear Energy Transfer，LET）及亚细胞精度杀伤潜能，二者均为极具前景的放射性诊疗（theranostic）核素。然而DOTA偶联Angiopep-2并分别标记177Lu与161Tb尚未见系统研究。本研究旨在填补此空白，构建DOTA-AP-2放射性诊疗平台，系统评价其放射化学特性、体外稳定性、细胞毒性及在正常小鼠体内的生物分布特征，为后续胶质瘤靶向放射性诊疗研究提供临床前依据。本文发表于《Journal of Peptide Science》。
二、主要关键技术方法概述
研究人员采用固相多肽合成（Solid-Phase Peptide Synthesis，SPPS，Fmoc/tBu策略）在Rink酰胺树脂上合成C端酰胺化的Angiopep-2，并在固相上将DOTA-tris(tBu)酯偶联至肽N端制得DOTA-Angiopep-2，经三氟乙酸（Trifluoroacetic Acid，TFA）裂解、沉淀、冻干获得粗品，反相高效液相色谱（Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC）纯化，电喷雾电离四级杆飞行时间质谱（Electrospray Ionization Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry，ESI-QToF MS）确证分子量。以T98人胶质母细胞瘤细胞为对象，经台盼蓝排斥法测定不同浓度AP-2（20–100 μM）处理72小时后的细胞活力并计算半数抑制浓度（Half Maximal Inhibitory Concentration，IC50）。DOTA-AP-2分别与[177Lu]LuCl3及[161Tb]TbCl3在醋酸钠缓冲液（pH 4.9，90°C，1 h）条件下进行放射性标记，放射性薄层色谱（Instant Thin Layer Chromatography on Silica Gel，ITLC-SG）评估放射化学产率与纯度。体外稳定性考察包括室温放置稳定性（最长10天）及161Tb标记物与人血清37°C孵育稳定性（最长10天），ITLC-SG监测降解。体内实验选用6–8周龄健康Carworth Farms Webster（CFW）小鼠（雌雄兼用，n=3/时间点），尾静脉注射[161Tb]Tb-DOTA-AP-2（550–600 kBq/只）后于5分钟及60分钟 post injection（p.i.）安乐死取主要脏器，自动γ计数器测定每克组织放射性并以%IA/g表示，计算脑/血比值。
三、研究结果
3.1 Synthesis and Characterization of AP-2 and DOTA-AP-2（AP-2及DOTA-AP-2的合成与表征）
研究人员通过SPPS成功合成了AP-2及其DOTA偶联物DOTA-AP-2，ESI-QToF MS检测到相应多电荷离子峰，RP-HPLC分析显示两者纯度较高。结果表明DOTA可高效偶联于AP-2 N端且不影响肽骨架完整性，为后续放射性标记奠定化学基础。
3.2 Cytotoxicity Evaluation of AP-2（AP-2的细胞毒性评价）
研究人员以T98胶质母细胞瘤细胞测试游离AP-2的细胞毒性，20 μM时细胞存活率约100%，随浓度升高至60–100 μM呈中度下降趋势，IC50为58.5 μM。结果表明AP-2本身在低至中等浓度下对胶质瘤细胞无明显毒性，具备作为靶向载体的良好安全性。
3.3 Radiolabeling Studies of DOTA-AP-2 With 177Lu and 161Tb（DOTA-AP-2与177Lu及161Tb的放射性标记研究）
研究人员将DOTA-AP-2分别与177Lu和161Tb在90°C孵育1小时后，ITLC-SG分析显示游离放射性金属离子<1%，放射胶体<1.2%，放射化学纯度（Radiochemical Purity，RCP）>95%（161Tb标记实测RCP为97.99%）。结果表明DOTA与两种放射性镧系金属形成稳定络合物，标记工艺简便、产率高，满足后续实验要求。
3.4 In Vitro Stability Studies of [177Lu]Lu-DOTA-AP-2 and [161Tb]Tb-DOTA-AP-2（两种标记物的体外稳定性研究）
研究人员发现两标记物在室温下放置10天RCP基本不变，表明优异的存放稳定性。与人血清37°C孵育时，最初24小时内稳定，随后逐渐出现Rf≈0.5的新放射性峰（提示肽链被血清蛋白酶降解），至第10天时完整标记物剩余约19.73%±5.62%。结果表明标记物在生理环境中会发生预期的肽链酶解，但短期（数小时内）可维持完整性，且快速血清清除可能降低非靶器官蓄积风险。
3.5 Ex Vivo Biodistribution Studies of [161Tb]Tb-DOTA-AP-2（[161Tb]Tb-DOTA-AP-2的离体生物分布研究）
研究人员在健康CFW小鼠中发现：[161Tb]Tb-DOTA-AP-2血清除极快（5 min 8.27%±0.96%IA/g → 60 min 0.33%±0.06%IA/g），肾脏摄取最高且持续（~53–55%IA/g），符合小分子多肽以肾途径排泄的特征。脑关联放射性5 min为0.24%±0.05%IA/g，60 min略降至0.10%±0.06%IA/g；脑/血比由5 min的0.028升至60 min的0.339（约12倍增长），反映血循环清除快于脑组织清除，有利于成像对比度建立。其他主要脏器摄取低。结果表明DOTA-AP-2标记物可在正常小鼠中检测到脑关联信号并通过LRP1介导潜在BBB穿透能力，为胶质瘤模型中的靶向评价提供依据。
四、讨论与结论翻译
讨论与结论：本研究构建了一种合理设计的基于多肽的放射性诊疗平台，整合三个关键组分——BBB穿透肽Angiopep-2、DOTA螯合剂及放射性核素177Lu与161Tb。所选放射性金属兼具治疗与成像能力，可发展出模块化、靶向性系统用于胶质瘤研究。结果证明DOTA-AP-2平台具高放射标记稳定性，且在未灌注的健康小鼠模型中观察到初步的脑关联放射性。AP-2本身在低浓度下耐受良好（DOTA-AP-2及相应金属配合物的细胞毒性有待进一步评价）。AP-2与DOTA-AP-2的成功合成、DOTA-AP-2与177Lu和161Tb的有效标记以及161Tb-DOTA-AP-2的初步生物学评价提供了鼓舞人心的基线数据，为AP-2基类放射性金属偶联物在CNS靶向研究中的进一步评价奠定了放射化学与生物分布基础。未来研究拟在相关体内胶质瘤模型中深入评估药代动力学、肿瘤靶向效率及治疗效力，最终目标是实现神经肿瘤学领域的临床转化。
