昼夜节律相关的血清素/褪黑素水平通过NOS3–NO通路调控顺铂耳毒性的易感性

《Journal of Pineal Research》：Circadian-Related Serotonin/Melatonin Level Modulates Cisplatin Ototoxicity Susceptibility Depended on NOS3–NO Pathway

　　

摘要：听力障碍可由年龄、遗传易感性和环境因素引起，其中环境因素属可干预因素，不良生活方式的作用尤为关键，但其致聋机制尚不清楚。本研究表明，光照紊乱所致激素失衡可显著增加感音神经性听力损失的易感性。在小鼠模型中，昼夜节律紊乱使内耳褪黑素(melatonin)降低、血清素(serotonin, 5-HT)升高，从而增强顺铂(cisplatin)诱导的耳毒性易感性。在体内及体外顺铂处理模型中，研究人员发现褪黑素联合处理可保护听力、减少内耳细胞死亡并保留突触连接，而血清素共处理则加重损伤。通过小分子–蛋白互作预测，研究人员鉴定内皮型一氧化氮合酶(NOS3, endothelial nitric oxide synthase / eNOS)为褪黑素与血清素的共同潜在作用靶點，二者经由NOS3调控一氧化氮(NO)信号通路并影响毛细胞铁死亡(ferroptosis)。最后，在外周给予重组NOS3蛋白可有效减轻甚至昼夜节律紊乱条件下顺铂所致毛细胞损伤。上述结果表明，内耳褪黑素/血清素平衡通过NOS3–NO信号通路调控感音神经性听力损失易感性。

论文解读：《Circadian-Related Serotonin/Melatonin Level Modulates Cisplatin Ototoxicity Susceptibility Depended on NOS3–NO Pathway》（发表于 Journal of Pineal Research）

一、研究背景与立项依据

全球约有4.3亿人患有致残性听力损失，预计2030年将超过5亿。除噪声暴露和耳毒性药物等已知因素外，长期不良生活方式（如睡眠与光照节律异常）是否为独立危险因素尚不清楚。已有证据表明感音神经性听力损失易感性存在昼夜波动，昼夜节律紊乱可加重噪声性聋并升高耳蜗氧化应激，且化疗药顺铂(cisplatin)的耳毒性也存在昼夜敏感性差异，但昼夜节律紊乱是否及如何影响顺铂耳毒性预后、其分子机制均未阐明。褪黑素(melatonin)合成与分泌呈典型昼夜节律，其前体为血清素(serotonin, 5-HT)，二者在内耳维持动态平衡；褪黑素具强抗氧化、抗凋亡及抗铁死亡作用，而5-HT在某些耳毒性模型中可加重毛细胞凋亡。目前尚无研究揭示昼夜节律是否通过调控内耳褪黑素/血清素平衡来介导顺铂耳毒性易感性。因此，本研究旨在明确昼夜节律紊乱→内耳褪黑素合成受阻/5-HT蓄积→通过NOS3(endothelial Nitric Oxide Synthase, NOS3/eNOS，内皮型一氧化氮合酶)–NO信号轴影响毛细胞铁死亡(ferroptosis, 铁依赖性脂质过氧化驱动的程序性细胞死亡)→顺铂耳毒性这一级联机制，并为防治提供靶点依据。

二、主要关键技术方法概述

研究人员采用6周龄野生型C57BL/6小鼠，建立三种光周期预处理模型——12 h光/12 h暗(LD)、持续光照(LL)、持续黑暗(DD)，随后予以3个周期的腹腔顺铂(3.5 mg/kg/day × 4 d，间隔10 d恢复)。分组包括：对照组(生理盐水)、顺铂组、顺铂+褪黑素(20 mg/kg,i.p.)、顺铂+血清素(20 mg/kg,i.p.)，及顺铂+NOS3重组蛋白(经后半规管注入模拟外淋巴液或2 μg重组NOS3蛋白)。听功能检测采用听性脑干反应(ABR, Auditory Brainstem Response)与畸变产物耳声发射(DPOAE, Distortion Product Otoacoustic Emission)。体外采用生后2–3 d(P2–P3)小鼠基底膜及螺旋神经节神经元外植体培养，给予顺铂±褪黑素/血清素处理。检测手段含：ELISA测定血清及耳蜗/外植体褪黑素、5-HT及NO(Griess法)；免疫荧光定量毛细胞(Myosin VIIa)、内毛细胞突触(Homer1/CtBP2共定位)、支持细胞(SOX2)、听神经纤维(Neurofilament/Tuj1)及螺旋神经节神经元胞体；活性氧(ROS, MitoSOX Red)、脂质过氧化(BODIPY 493/503)、胞内及线粒体内Fe²⁺(FerrOrange/Mito FerroGreen)、铁死亡标志物转铁蛋白受体(TfR, Transferrin Receptor)；Western blot检测NOS3、磷酸化NOS3(p-NOS3, Ser1177)及相关铁死亡蛋白；小分子–蛋白互作预测结合分子对接验证NOS3为褪黑素与5-HT共同靶点。

三、研究结果

1 Introduction（引言部分结论归纳）

研究人员综述指出：昼夜节律通过激素(如糖皮质激素、褪黑素/5-HT)调控听觉敏感性；顺铂耳毒性具昼夜时相差异但节律紊乱的影响未明；内耳褪黑素/5-HT平衡可能介导该过程，NOS3–NO通路或为下游机制。

2 Materials and Methods（见上述方法概述，此处不再重复展开）

2.3 Auditory Function Testing 结果相关说明

ABR与DPOAE检测显示：LL(持续光照，模拟昼夜节律紊乱)组顺铂处理后听阈偏移显著大于LD组，DPOAE幅值降低更明显；褪黑素预处理可部分逆转听阈升高与外毛细胞功能下降，5-HT共处理则恶化；外源性NOS3蛋白回补可在LL背景下改善ABR阈值。

2.11 Measurement of Melatonin and Serotonin 结果相关说明

研究人员测得LL条件下小鼠血清及耳蜗组织中褪黑素水平显著低于LD组，5-HT水平显著升高，褪黑素/5-HT比值下降；顺铂本身不改变此比值但放大功能后果。外源褪黑素可恢复耳蜗褪黑素水平，外源5-HT进一步压低比值。

2.9 NOS3 Level Measurement 结果相关说明

体外顺铂处理下调基底膜外植体中NOS3总蛋白及磷酸化形式p-NOS3(Ser1177)表达，降低NO生成；褪黑素共处理上调NOS3/p-NOS3及NO水平，逆转顺铂效应；5-HT共处理进一步抑制NOS3/p-NOS3及NO。生物信息学预测与分子对接显示褪黑素可结合并稳定NOS3活性构象，5-HT则具相反倾向。

2.7 Reactive Oxygen Species (ROS) and Lipid Peroxidation Detection 与 2.8 Fe²⁺Detection 及 2.10 Ferroptosis Detection 结果相关说明

顺铂组毛细胞内MitoSOX Red(ROS)、BODIPY(lipid peroxidation)及FerrOrange/Mito FerroGreen(Fe²⁺)荧光强度显著升高，Parvalbumin/TfR双阳性铁死亡毛细胞比例增加；褪黑素共处理显著降低上述指标，5-HT共处理使其进一步升高；在外体给予重组NOS3可拮抗顺铂引起的ROS、脂质过氧化、Fe²⁺蓄积及铁死亡毛细胞增多，即便在LL条件下亦如此。

2.5–2.6 Immunofluorescence Staining 与 Image Processing and Quantitative Analysis 结果相关说明

Myosin VIIa阳性毛细胞密度在顺铂+LL组最低，褪黑素预处理显著保留内外毛细胞数量及F-actin束完整性，5-HT共处理加速毛细胞丢失；内毛细胞底部Homer1/CtBP2双标突触点数在顺铂组减少，褪黑素可保留突触，5-HT加剧突触丢失；SOX2阳性支持细胞及Tuj1阳性螺旋神经节神经元/听神经纤维密度变化趋势一致——褪黑素具保护作用，5-HT加重退变，NOS3回补可缓解。

四、讨论与结论翻译总结

研究人员在讨论中指出，本研究首次证实昼夜节律紊乱通过损害内耳褪黑素合成、导致褪黑素/血清素失衡(褪黑素↓/5-HT↑)，进而抑制NOS3–NO信号轴，诱发毛细胞氧化应激与铁死亡，最终增加顺铂耳毒性易感性。褪黑素通过激活NOS3(p-NOS3 Ser1177)↑→NO↑拮抗该过程，5-HT则抑制NOS3–NO通路加重损伤；局部补充重组NOS3可阻断此级联并保护听力。局限在于尚未完全解析耳蜗局部褪黑素合成酶(如AANAT, ASMT)在昼夜节律下的具体调控细节。临床意义上，维护正常昼夜节律、纠正褪黑素/5-HT失衡或靶向NOS3激活可为顺铂化疗患者预防耳毒性提供新策略。

研究结论（原文结论浓缩翻译）：

昼夜节律相关的内耳褪黑素/血清素平衡经由NOS3–NO信号通路调控顺铂诱导的感音神经性听力损失易感性；昼夜节律紊乱致褪黑素不足与5-HT蓄积，抑制NOS3磷酸化及NO生成，促进毛细胞铁死亡与突触/神经元退变；外源褪黑素或局部NOS3回补可逆转上述损伤。该研究为以生活方式干预(节律维护)、激素平衡调节及NOS3靶向手段预防顺铂耳毒性奠定了理论基础。