GluD1定位于胆碱能突触并是一种乙酰胆碱受体

《Molecular Psychiatry》：GluD1 is localized at cholinergic synapses and is an acetylcholine receptor

　　

谷氨酸δ受体1（GluD₁）具有许多不寻常特征，包括在兴奋性和抑制性突触均有表达，以及配体结合域（LBD）能够结合D-丝氨酸和γ-氨基丁酸（GABA）。研究人员先前已证实，纹状体GluD₁对行为灵活性的调节至关重要，该表型依赖于胆碱能系统。在此，研究人员发现GluD₁在小鼠和猴背侧纹状体的胆碱能突触后富集。此外，GluD₁缺失会减少胆碱能末梢的丰度、胆碱能突触的兴奋性反应以及毒蕈碱受体诱导的可塑性。另外，在胆碱能受体及α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体/γ-氨基丁酸A型受体（AMPA/GABA_A）阻断剂存在下，对胆碱能中间神经元进行光遗传刺激或局部喷施乙酰胆碱（ACh），可在中棘神经元（MSNs）中产生对GluD₁通道阻断剂NASPM敏感电流响应。这些响应在GluD₁基因敲除（KO）小鼠中消失，而在KO背景上过表达GluD₁可挽救ACh喷施诱导的电流，提示可能存在经GluD₁的电导。最后，研究人员利用GluD₁-小脑蛋白1（Cbln1）相互作用测定作为评估配体结合相互作用的间接方法，发现ACh可结合GluD₁并诱导构象变化。在细胞结合测定中，GluD₂也观察到类似的ACh诱导构象变化。重要的是，分子动力学模拟和突变分析表明，ACh在GluD₁配体结合域中的结合取向不同于D-丝氨酸和GABA。总体上，研究结果揭示了GluD₁在调节胆碱能突触方面的前所未有特征。

这篇发表于《Molecular Psychiatry》的研究深入探讨了谷氨酸δ受体1（GluD₁）在胆碱能突触中的新功能。离子型谷氨酸受体（iGluRs）家族包括AMPA、红藻氨酸、NMDA和δ受体。其中谷氨酸δ受体（GluDs）独具特色，在异源表达系统中不表现典型的配体门控离子通道活性，但内源性神经递质如D-丝氨酸、甘氨酸和γ-氨基丁酸（GABA）可结合其配体结合域（LBD）并诱导构象变化。此外，GluDs通过与小脑蛋白（Cblns）和神经黏连蛋白形成跨突触复合体，促进突触形成与维持。先前研究表明，背侧纹状体中的GluD₁对认知行为灵活性至关重要，而这一表型高度依赖胆碱能系统。然而，GluD₁与胆碱能系统的具体关系尚未明确，其是否定位于胆碱能突触、参与调节胆碱能突触功能及离子电导尚属未知。因此，研究人员开展本研究，旨在揭示GluD₁在胆碱能突触的定位及其潜在功能作用。

研究人员首先利用免疫组化和免疫电镜技术，在小鼠和猴背侧纹状体中确认GluD₁定位于胆碱能突触后。随后，通过免疫印迹、全细胞膜片钳记录和光遗传学等手段，发现GluD₁缺失导致胆碱能末梢减少、毒蕈碱受体介导的可塑性受损，以及一种对GluD₁通道阻断剂NASPM敏感的离子电导消失。进一步，通过细胞结合实验、分子动力学模拟和定点突变，证实乙酰胆碱（ACh）可直接结合GluD₁并诱导构象变化，且其结合模式不同于D-丝氨酸和GABA。研究还通过条件性敲除和挽救实验验证了GluD₁在介导ACh诱导电流中的必要性。

研究采用了多种关键技术方法。首先，利用免疫组织化学和免疫电子显微镜（使用小鼠和3只恒河猴的脑组织）确定GluD₁的亚细胞定位。其次，通过制备突触神经小体进行免疫印迹分析，评估胆碱能标记物的蛋白水平变化。全细胞膜片钳记录（来自小鼠脑片）用于测量中棘神经元（MSNs）的电生理响应，并结合光遗传学激活胆碱能中间神经元及局部喷施ACh。此外，采用基于GluD₁-Cbln1相互作用的细胞结合实验（在HEK293T和COS-7细胞中）作为配体结合读出不。分子动力学模拟和定点突变用于解析ACh的结合机制。

研究结果分为以下部分：

**1. GluD₁定位于胆碱能末梢**：通过免疫荧光共定位和免疫电镜，发现GluD₁与囊泡乙酰胆碱转运体（vAChT）和胆碱乙酰转移酶（ChAT）共定位，且在猴和小鼠背侧纹状体以及小鼠脚间核（IPN）的vAChT阳性突触后富集，提示跨物种保守性。

**2. GluD₁对维持纹状体胆碱能突触至关重要**：在全局和纹状体特异性GluD₁敲除小鼠中，背侧纹状体和中央杏仁核的vAChT蛋白水平显著降低，而ChAT表达增加（可能为代偿效应）。功能上，GluD₁缺失削弱了毒蕈碱激动剂卡巴胆碱诱导的NMDA受体mEPSC抑制，表明胆碱能突触功能受损。

**3. 光遗传刺激揭示MSN中GluD₁依赖性离子电导**：在野生型MSN中，光遗传激活CINs诱发的内向电流在阻断谷氨酸、GABA和胆碱能受体后仍存在残余电流，该电流对NASPM敏感；而在GluD₁敲除MSN中，阻断剂完全消除电流，且无NASPM敏感性。输入-输出曲线进一步证实GluD₁缺失导致电流幅度降低。

**4. 乙酰胆碱诱导MSN中NASPM和GluD₁缺失敏感的离子通道电流**：在阻断已知受体后，局部喷施ACh在野生型MSN中诱发内向电流，该电流被NASPM和戊烷脒抑制，而在GluD₁敲除MSN中基本消失。通过过表达GluD₁进行挽救实验，可恢复ACh诱导电流，且电流-电压关系显示逆转电位约0 mV，呈非选择性阳离子电导特性，并高度依赖细胞外Ca²⁺。

**5. 乙酰胆碱诱导GluD₁的结合与构象变化**：在细胞结合实验中，ACh浓度依赖性地降低GluD₁与Cbln1的结合，IC₅₀约3 mM。类似效应在GluD₂中同样观察到。其他胆碱能配体如尼古丁和野靛碱无效，而卡巴胆碱有效，提示GluD₁配体结合域的药理学特征独特。

**6. ACh结合GluD₁的分子决定因素**：分子动力学模拟显示，ACh在GluD₁配体结合域中的结合取向不同于D-丝氨酸和GABA；ACh不与R526形成盐桥，而是依赖E446等残基。突变分析表明，GluD1^R526K突变消除了D-丝氨酸和GABA的作用，但保留并增强了ACh的亲和力（IC₅₀降至0.2 μM），而GluD1^E446Q突变则特异性地消除了ACh的效果。在脑片电生理中，表达GluD1^R526K的MSN未观察到ACh诱导电流，提示高亲和力可能使受体进入脱敏样状态。

讨论部分总结：该研究发现GluD₁在胆碱能突触的定位及对突触维持的新功能。GluD₁缺失导致胆碱能末梢减少及功能缺陷。光遗传和ACh喷施实验揭示GluD₁介导的离子电导，且该电导具NASPM敏感性和Ca²⁺依赖性。细胞结合实验证明ACh直接结合并诱导GluD₁构象变化，结合位点与D-丝氨酸/GABA不同，关键残基E446为ACh所必需。ACh在突触间隙可能达到mM级浓度，支持其生理相关性。GluD₁的独特配体结合域架构使其能够响应多种神经递质，可能通过不同构象变化导致不同下游信号输出。

**研究结论部分翻译**：GluD₁受体被赋予了诸多不寻常的特征，使其与其他离子型谷氨酸受体（iGluRs）区分开来，其中最近引起关注的是其形成跨突触桥并促进兴奋性和抑制性突触形成的能力。在结构-功能层面，其非交换的氨基末端结构域（ATD）-配体结合域（LBD）架构以及不仅结合D-丝氨酸、还能结合GABA的能力，进一步增加了其独特性。本研究证明了GluD₁在胆碱能突触的定位和功能。重要的是，研究人员证明乙酰胆碱（ACh）能结合GluD₁并诱导构象变化。考虑到纹状体和皮质边缘区域中的ACh及胆碱能受体是突触可塑性、学习和记忆功能的关键调节因子，并且这些功能的破坏发生在帕金森病、阿尔茨海默病和神经精神疾病中，本研究结果提出了一种可能性，即部分效应可能依赖于GluD₁。发现ACh作为谷氨酸受体的配体，为离子通道的基础生物学和进化以及药物发现开辟了新途径。