长链S-酰化是巨噬细胞炎症反应中的关键调节因子

《Molecular & Cellular Proteomics》：Long-chain S-acylation is a key modulator during the macrophage inflammatory response

　　

长链S-酰化（Long-chain S-acylation）是一种可逆的脂质修饰，对调节蛋白质定位、稳定性和信号传导至关重要，但其在巨噬细胞介导的炎症中的作用仍不完全清楚。在本研究中，研究人员将基于氨基酸稳定同位素标记（Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC）与位点特异性酰基-生物素交换（site-specific acyl-biotin exchange, ssABE）相结合，生成了极化为M0和M(LPS+IFNγ)状态的THP-1巨噬细胞中长链S-酰化景观的全面图谱。定量蛋白质组学揭示了极化特异性的S-酰化模式，并发现了大量炎症相关的修饰位点，包括新的S-酰基肽型（S-acyl peptidoforms），即同一肽段的不同S-酰化变体，例如WARS（C305/C309），突出了它们在巨噬细胞激活中的潜在相关性。使用广谱抑制剂2-溴棕榈酸酯（2-bromopalmitate）对S-酰化的药理学抑制会抑制关键促炎趋化因子（CXCL9、CXCL10、CCL4）的分泌，并破坏IDO1介导的色氨酸分解代谢，而Palmostatin B主要稳定G蛋白偶联受体（GPCR）信号蛋白上的S-酰化。总之，这些发现将长链S-酰化定位为巨噬细胞激活过程中的关键调控机制，以及炎症性疾病治疗干预的有前景靶点。

长链S-酰化（Long-chain S-acylation）是一种可逆的脂质修饰，通过脂肪酸与蛋白质半胱氨酸残基形成硫酯键，调控蛋白质定位、稳定性与信号传导，在人类蛋白质组中广泛存在。巨噬细胞利用长链S-酰化调节趋化因子信号、NOD和Toll样受体等通路，其失调与炎症性肠病、肝脏炎症等疾病相关。然而，现有研究多基于蛋白质层面的检测，缺乏位点特异性分辨率，且对炎症巨噬细胞中长链S-酰化动态图谱的理解有限。为填补这一空白，研究人员开展了系统性研究，旨在构建位点特异性定量图谱，并探讨长链S-酰化在巨噬细胞炎症反应中的作用。

研究人员主要采用以下关键技术方法：（1）基于稳定同位素标记（SILAC）的定量蛋白质组学，对THP-1细胞（来自ATCC，TIB-202，传代次数低于20）进行重标或轻标，并极化为M0和M(LPS+IFNγ)巨噬细胞；（2）位点特异性酰基-生物素交换（ssABE）策略，通过双N-乙基马来酰亚胺（NEM）烷基化封闭游离半胱氨酸、羟胺（HA）选择性裂解硫酯键、HPDP-生物素标记新生硫醇，再经链霉亲和素富集肽段后以TCEP（三(2-羧乙基)膦）洗脱并进行2-氯乙酰胺（CAA）烷基化，结合nano-LC-MS/MS分析鉴定S-酰化位点；（3）药理学抑制实验，使用广谱ZDHHC S-酰基转移酶抑制剂2-溴棕榈酸酯（2-BP）或广谱蛋白硫酯酶抑制剂Palmostatin B（PalmB）处理M(LPS+IFNγ)巨噬细胞，分析蛋白质组、分泌组及S-酰基蛋白质组变化。

**建立稳健且灵敏的ssABE策略检测长链S-酰化**：研究人员通过优化ssABE流程，在洗脱后增加CAA烷基化步骤以稳定新生半胱氨酸，并采用双NEM烷基化减少假阳性。在无标实验中，对M(LPS+IFNγ)和M0巨噬细胞进行的ssABE分析共鉴定出3083个假定的长链S-酰化位点（映射至1880个独特母蛋白），其中仅11%的位点先前在SwissPalm数据库中有记录，但70%的母蛋白曾被报道。峰度图显示含半胱氨酸肽段富集效率达96-99%，+HA样本与-HA样本在主成分分析中清晰分离，验证了方法的有效性。

**LPS+IFNγ处理THP-1巨噬细胞产生独特的促炎特征**：通过SILAC总蛋白质组分析，研究人员确认M(LPS+IFNγ)巨噬细胞中JAK-STAT信号通路、HLA II类抗原呈递、色氨酸分解代谢、促炎细胞因子分泌等通路显著上调，抗炎标志物TREM2和LPS共受体CD14下调，与经典的巨噬细胞促炎激活一致。

**位点特异性S-酰基蛋白质组分析揭示促炎巨噬细胞中长链S-酰化的上调**：SILAC ssABE共鉴定1111个S-酰化半胱氨酸位点（769个母蛋白），其中11个位点仅在促炎巨噬细胞中检测到。M(LPS+IFNγ)巨噬细胞中长链S-酰化整体丰度高于M0细胞，73%的母蛋白仅含单个可检测位点，38%的母蛋白含至少一个跨膜结构域（TMD），显著高于总蛋白质组中24%的比例。多通道跨膜蛋白的富集尤其明显。高丰度位点包括磷脂爬行酶1（PLSCR1）的C148-149等，且PLSCR1多个位点在促炎状态下显著上调。关键炎症相关位点如P2RX7（C4-5等）和Gasdermin D（GSDMD）的C191被确认。比较位点与母蛋白表达变化，发现大多数位点丰度变化由母蛋白水平驱动，但少数例外，如TOR4A的C21和Syntaxin-11（STX11）的C端多位点，其S-酰化上调独立于蛋白质丰度变化。末端Cys长链S-酰化见于多个外周膜蛋白如SCRIB（C4），提示其作为脂质锚定物。在跨膜蛋白中，34个蛋白的S-酰化位点位于TMD边界5个残基内，其中多个位点在炎症中显著上调。

**鉴定多位点长链S-酰化肽型**：研究人员共鉴定102个母蛋白的118个多位点肽段（含超过1个S-酰化半胱氨酸）。在含两个Cys的肽段中，相邻位点（无间隔）更常以双S-酰化形式存在（>70%），而间隔位点则更多以单S-酰化形式出现。不同肽段呈现差异性分布，如WARS的C305与C309在M(LPS+IFNγ)巨噬细胞中约各占50%单酰化，JAK1的C10、C16以双酰化为主，TMEM134的C108-C109在未刺激时均分，刺激后几乎全部双酰化。PI4K2A的CCPCC基序以四酰化为主要形式。这些结果表明长链S-酰化肽型可能受细胞环境调控。

**用APT和ZDHHC抑制剂调节长链S-酰化调控LPS+IFNγ刺激后的炎症反应**：对M(LPS+IFNγ)巨噬细胞分别给予2-BP或PalmB处理后，2-BP处理导致165个蛋白质上调、107个蛋白质下调（相比溶剂对照），包括多种促炎标志物（IDO1、ISG20、WARS等）降低，但细胞活力下降约20%；分泌组中57个分泌蛋白中有15个显著下调，包括CXCL9、CXCL10、CCL4等趋化因子，且这些蛋白在蛋白质组中未显著变化，提示2-BP特异性抑制其分泌。PalmB处理对蛋白质组和分泌组无显著影响，但在S-酰基蛋白质组中稳定了93个位点，主要是GPCR信号蛋白（如GNA11、GNA13、GNA15、GNAQ、GTPBP2）以及炎症相关蛋白CD38、TNFAIP2、PI4K2A等。JAK1的C10和C16被稳定，且其在SSABE中以双酰化为主。此外，TLR1/6的C614-619位点被稳定，CXCL9的C31或C33位点被鉴定为长链S-酰化，且2-BP抑制其分泌但PalmB无影响，表明S-酰化添加而非去除对CXCL9分泌关键。

**讨论与结论**：研究人员讨论了方法的局限性，指出ABE方法无法区分长链与其他酰基种类，但长链S-酰化是哺乳动物细胞中主要的硫酯连接修饰。综合来看，研究证明长链S-酰化是巨噬细胞激活过程中动态调控且具有功能意义的特征，药理学调控S-酰化与脱酰化的平衡可影响炎症反应，为炎症性疾病治疗提供了潜在靶点。结论部分原文翻译如下：“我们应用基于SILAC的ssABE方法于THP-1巨噬细胞，生成了M0和M(LPS+IFNγ)极化状态下3083个假定长链S-酰化位点的基准数据集。全蛋白质组分析确认了预期的极化标志物，并揭示了一个动态的、对炎症敏感的长链S-酰化景观，包括已知位点如P2RX7（C5、C6、C7）和GSDMD（C191），以及新位点如CLTC（C1205）、CD40（C258）、CCR7（C358）和CD38（C15、C16）。我们进一步鉴定了超过100个肽段的S-酰基肽型，即同一肽段的不同位点特异性修饰变体，其中一些在M(LPS+IFNγ)和M0巨噬细胞中丰度不同（例如WARS C305和C309）。虽然这反映的是生物学调控还是技术效应尚不能完全确定，但数据支持存在不同的S-酰化肽段物种，突显长链S-酰化调控的潜在复杂性，并强调了位点特异性分析的关键重要性。药理学扰动长链S-酰化产生不同效果：抑制S-酰化添加（2-BP）显著抑制关键促炎趋化因子（CXCL9、CXCL10、CCL4）的分泌并削弱广泛的炎症蛋白表达；抑制脱酰化（PalmB）则稳定特定调控节点上的长链S-酰化，特别是GPCR信号蛋白，而不改变全局蛋白质组或分泌组。需要注意的是，基于ABE的方法广泛捕获硫酯连接的半胱氨酸修饰，不区分长链与其他酰基种类；虽然长链S-酰化被认为是哺乳动物细胞中主要的硫酯连接酰基修饰，但将观察到的炎症表型完全归因于长链S-酰化需谨慎。尽管如此，这些发现支持一个模型，即长链S-酰化是巨噬细胞激活中动态调控且具有功能意义的特征，调节S-酰化与脱酰化的平衡可影响炎症反应。鉴于巨噬细胞在炎症驱动疾病中的核心作用，这些数据集为进一步研究长链S-酰化在免疫调控及其潜在治疗相关性方面提供了资源和框架。”