《Nano Today》：Engineered artificial bacterial nanovesicles displaying CHIKV multi-epitope antigens elicit potent protective immunity
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宋明瑞|吴冰冰|王恒|戴华兴|姚晨璐|孙荣|徐芳|阿德米尔·杜贝|曹燕|王超中国江苏省苏州市苏州大学功能纳米与软材料研究所（FUNSOM）生物材料与免疫工程实验室，邮编215123摘要基孔肯雅病毒（CHIKV）对全球健康构成了重大威胁，其反复爆发会导致急性且常常是慢性的致残性疾病
宋明瑞|吴冰冰|王恒|戴华兴|姚晨璐|孙荣|徐芳|阿德米尔·杜贝|曹燕|王超
中国江苏省苏州市苏州大学功能纳米与软材料研究所（FUNSOM）生物材料与免疫工程实验室，邮编215123
摘要
基孔肯雅病毒（CHIKV）对全球健康构成了重大威胁，其反复爆发会导致急性且常常是慢性的致残性疾病。本研究提出了一种基于工程化人工细菌纳米囊泡（E-aBNV）的疫苗平台来对抗CHIKV。通过利用免疫信息学和人工智能分析保守的病毒序列，我们设计了一种包含选定的MHC I类、MHC II类和B细胞表位的多表位抗原。该抗原被展示在非复制的革兰氏阴性细菌囊泡表面。E-aBNV疫苗利用了细菌纳米囊泡（BNVs）的天然佐剂特性，从而无需外源性佐剂。在小鼠模型中，肌肉注射诱导了强烈的全身免疫反应，包括有效的中和抗体和Th1偏向的细胞反应。这种多表位策略旨在增强免疫原性并扩大保护范围。该平台为开发低成本且可扩展的疫苗提供了有希望的途径，其模块化设计便于快速适应新出现的病毒威胁。
引言
基孔肯雅病毒（CHIKV）是一种属于甲病毒属（Alphavirus）的单链正链RNA病毒，属于托加病毒科（Togaviridae）。它由埃及伊蚊（Aedes aegypti）和白纹伊蚊（Aedes albopictus）传播[1]、[2]、[3]。自1952年在坦桑尼亚首次发现以来，CHIKV已传播到全球100多个国家和地区，每年感染约1690万人，近28亿人面临传播风险[4]。例如，2025年中国经历了最大规模和最广泛的基孔肯雅病毒本地传播，表明疫情风险显著增加。该病毒会导致高烧、头痛、皮疹和严重的多关节痛，急性期持续2-3周[5]、[6]。20%至70%的感染者会发展成慢性关节炎，症状可能持续数月甚至数年，严重影响生活质量并造成沉重的社会经济负担[2]、[7]。
前所未有的疫情清楚地凸显了开发基孔肯雅疫苗的必要性[1]、[8]、[9]。目前，两种减毒活疫苗（IXCHIQ?和CHIKV病毒样颗粒（VLP）存在安全性问题，如疫苗引起的关节痛[8]、[9]、[10]；VLP疫苗需要外源性佐剂[11]、[12]、[13]；mRNA疫苗需要持续的冷链运输[14]；而天然分泌的外膜囊泡（OMVs）产量低且内毒素水平高[15]。相比之下，我们开发的人工细菌纳米囊泡（E-aBNV）平台不复制，因此避免了关节痛风险，具有自佐剂作用，无需外源性佐剂，并且适合冻干处理，以减少对冷链的依赖。此外，E-aBNV的产量是天然OMVs的100倍，内毒素水平更低，并且能够快速更新表位以应对病毒变异株，从而实现低成本、可部署且适应性强的CHIKV疫苗。
OMVs是革兰氏阴性细菌自然分泌的纳米级囊泡。由于OMVs不复制且不含活病毒，因此比减毒活疫苗平台具有显著的安全优势[16]、[17]。与mRNA疫苗不同，基于OMV的疫苗不需要冷链运输，特别适合资源有限的地区[5]、[11]、[18]。此外，OMVs本身具有病原体相关的分子模式，赋予了内在的佐剂活性，能够在不需要外源性佐剂的情况下有效激活先天免疫反应[19]、[20]、[21]。这一特性支持了针对OMVs上呈现的基孔肯雅病毒抗原的强大体液和细胞免疫的诱导。OMV疫苗的另一个关键优势是其在抗原呈递方面的灵活性；可以将基孔肯雅病毒的结构蛋白或保守表位通过基因工程引入OMVs，从而实现精确的抗原设计，并有可能引发跨基因型的保护。重要的是，我们之前报道了一种可扩展的人工纳米囊泡制造策略[22]，这大大降低了生产成本，并能在疫情爆发时快速进行大规模生产。
在这项研究中，我们参考了从769种CHIKV菌株中鉴定出的保守E1/E2序列，并利用免疫信息学分析和人工智能（AI）工具选择了四个MHC I类限制的T细胞表位、四个MHC II类限制的T细胞表位和两个B细胞表位[23]、[24]、[25]。这些表位随后被串联排列并展示在大肠杆菌的表面膜蛋白上，然后制备成E-aBNVs用于抗原呈递。这种多表位呈递策略增强了免疫原性，同时降低了单一表位靶向相关的免疫逃逸风险[26]、[27]、[28]。小鼠肌肉注射诱导了强烈的全身免疫反应，证实了该平台能够引发有效的中和抗体反应和Th1偏向的细胞免疫。这种方法为开发适用于流行地区的低成本、广谱CHIKV疫苗提供了新策略。此外，该平台的模块化设计允许通过简单替换表位序列快速适应新出现的突变株，从而实现高效的疫苗更新，比传统疫苗平台具有更好的可扩展性。
章节片段
E-aBNV的设计与表征
为了实现广谱交叉保护，我们通过分析769种CHIKV全基因组序列，参考了保守的E1/E2蛋白片段[23]。我们使用免疫信息学工具预测了适合BALB/c小鼠的T/B细胞表位，随后确定了四个亲和力最高的MHC I类T细胞表位、四个MHC II类T细胞表位和两个B细胞表位（见图S1a-c）。为了构建一个具有增强效果的抗原呈递系统
讨论
CHIKV在热带和亚热带地区的持续传播给公共卫生带来了重大负担，目前尚无广泛可用的特异性疫苗或抗病毒药物[5]、[37]。本研究结合了计算免疫学筛选、蛋白质工程和纳米疫苗技术，开发了一种基于工程化aBNVs的新型多价疫苗，为这些挑战提供了有希望的解决方案。
设计理念结合了计算的广度
表位选择与设计
所有表位预测都是针对BALB/c小鼠模型（H2单倍型）进行的。CHIKV的保守E1和E2蛋白序列来自之前对769种全球菌株的分析[23]。使用来自769种全球菌株的保守CHIKV E1/E2序列，对BALB/c小鼠（H2单倍型）进行了表位预测。对于MHC-I（H2-Kd, H2-Ld），通过IEDB选择了IC50 ≤ 500 nM且百分位排名< 1%的肽。
作者贡献
C.W.设计了项目。M.S.进行了实验，收集数据，分析并解释数据，并撰写了论文的第一版。所有作者都参与了结果讨论和论文的各个阶段的编辑。
CRediT作者贡献声明
孙荣：方法学研究。徐芳：项目管理。阿德米尔·杜贝：写作——审稿与编辑、研究、资金获取、概念化。曹燕：写作——审稿与编辑、资金获取。吴冰冰：研究。王恒：方法学研究。戴华兴：方法学研究。姚晨璐：方法学研究。宋明瑞：验证、项目管理、方法学研究。王超：写作——审稿与编辑、概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（资助编号：32371476、U25A20599、T2321005）的支持。本研究还得到了江苏省自然科学基金（编号：BK20255001）的资助。此外，本工作还得到了苏州纳米科学技术协同创新中心、江苏省高等教育机构自然科学基金（资助编号：22KJA180003）以及江苏省优先学术计划的部分支持。
