静电纺丝丝素蛋白纳米纤维负载金属纳米颗粒及酚酸用于抗菌应用

《Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine》：Electrospun silk fibroin nanofibers enriched with metallic nanoparticles and phenolic acids for antimicrobial applications

　　

研究人员制备了丝素蛋白(Silk Fibroin, SF)的纤维状有机-无机杂化膜，通过静电纺丝(Electrospinning)法制备SF纳米纤维垫，并采用惰性气体冷凝(Inert Gas Condensation, IGC)溅射法负载金属纳米颗粒(主要为银纳米颗粒Ag NPs和铜纳米颗粒Cu NPs)，以及采用旋涂(Spin-coating)法修饰酚酸类化合物——咖啡酸(Caffeic Acid, CA)、迷迭香酸(Rosmarinic Acid, RA)和鞣花酸(Ellagic Acid, EA)。研究人员利用扫描电镜/透射电镜(SEM/TEM)、能谱仪(EDX)、衰减全反射红外光谱(ATR-IR)、原子力显微镜(AFM)、X射线光电子能谱(XPS)、接触角测量仪(Goniometry)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)及体外直接和间接抗菌实验与细胞毒性实验对所得纳米纤维垫进行了精确表征。经优化的静电纺丝及后续表面功能化可获得具有确定结构均一性、抗菌活性及细胞相容性的无机-有机杂化纳米纤维垫。在所有测试的静电纺垫中，含Ag NPs和鞣花酸(SF_Ag NPs_EA)的垫被选中做进一步分析，因其兼具抗菌活性和降低的体外细胞毒性。所选酚酸在观察到的生物活性中起主要作用，同时对应负载NPs释放的Ag?离子毒性效应降低，共同贡献了所观察到的抗菌活性，并确保了对真核细胞(Eukaryotic cells)的细胞相容性。因此，这些先进的静电纺垫是具抗菌活性和生物安全性(Biosafe)的生物材料有力候选者，并为未来的工业应用提供了基础信息。

研究背景与意义

慢性伤口是严重的临床健康问题，易继发感染并可能导致脓毒症甚至死亡。日益严峻的抗菌药物耐药性(Antimicrobial Resistance, AMR)要求开发新型抗感染敷料。纳米疗法特别是基于天然高分子的静电纺纳米纤维敷料，因高比表面积、透气吸液性及可负载活性成分而备受关注。丝素蛋白(Silk Fibroin, SF)提取自家蚕(Bombyx mori)茧，具备优异的生物相容性、可降解性及易功能化特点，是理想的敷料基质。金属纳米颗粒(NPs，如Ag NPs、Cu NPs)具广谱抗菌性且不易诱导耐药，但高浓度金属离子可能造成细胞毒性；酚酸类多酚(如咖啡酸CA、迷迭香酸RA、鞣花酸EA)具抗氧化、抗炎及辅助抗菌作用。将二者复合于SF纳米纤维中以期协同抗菌并降低毒性。该研究发表于《Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine》。

主要关键技术方法

研究人员首先从家蚕(Bombyx mori)茧中提取SF溶液，配制含聚乙二醇(PEG)的纺丝液进行静电纺丝制得SF纳米纤维垫，随后经乙醇处理诱导β-折叠构象；采用惰性气体冷凝(IGC)磁控溅射法在垫表面沉积Ag NPs、Cu NPs或Ag/Cu混合NPs；再通过旋涂法负载CA、RA或EA乙醇溶液得到杂化垫。采用SEM、TEM、AFM观测形貌与NPs尺寸；ATR-IR分析分子构象；XPS分析表面元素化学态；接触角结合Owens-Wendt模型算表面能；ICP-MS检测PBS中离子与NPs释放量；热重(TG)与差示扫描量热(DSC)评估热稳定性。生物实验包括：微量肉汤稀释法测酚酸对金黄色葡萄球菌(S. aureus GFP)的最小抑菌浓度(MIC)及联合 fractional inhibitory concentration index(FICI)；直接接触与抑菌圈法评估对革兰氏阳性芽孢杆菌(Bacillus paramycoides)和革兰氏阴性大肠杆菌(Escherichia coli)的抗菌性；以人永生化角质形成细胞(HaCaT)为模型，通过Alamar Blue法测细胞活力、ROS荧光探针测氧化应激、JC-10法测线粒体膜电位(MMP)评估细胞相容性。

研究结果

Fibers morphology（纤维形貌）

静电纺SF纳米纤维呈随机取向平滑无纺形态，平均直径472 ± 10 nm（范围约200–1000 nm），AFM测得表面粗糙度R_a0.41 ± 0.06 μm，R_q0.52 ± 0.08 μm。ATR-IR谱中3288 cm^?1（N–H伸缩）、1626 cm^?1（酰胺I β-折叠）、1514 cm^?1（酰胺II）及1235 cm^?1（无规卷曲酰胺III）证实脱胶彻底且SF纯度良好，乙醇处理促使部分β-折叠形成。

Nanoparticles morphology（纳米颗粒形貌）

IGC法制备的Cu NPs平均粒径5.3 ± 0.7 nm（3–8 nm），HR-TEM见面间距1.80 ?对应Cu(200)，少量见Cu₂O(220)面(1.51 ?)；Ag NPs平均粒径4.9 ± 2.6 nm（1–10 nm），呈多晶，含金属Ag相(311)面1.23 ?、(220)面1.44 ?及Ag₂O(220)面1.67 ?；Ag/Cu混合NPs平均粒径5.9 ± 1.4 nm，可见合金相。ICP-MS测得Cu NPs负载量15.49 ± 0.73 μg/cm²，Ag NPs为3.39 ± 0.75 μg/cm²。

Nanoparticles surface chemistry（纳米颗粒表面化学）

XPS分析显示C 1s可拟合为C–C/C=C(285.0 eV)、C–OH/C–N(286.5 eV)、C=O(288.2 eV)；N 1s为C–NH(400.0 eV)；O 1s含O=C(531.7 eV)和O–C/O–H(532.7 eV)。Cu 2p_3/2含金属Cu/Cu?(932.6 eV)、Cu2?(933.8 eV, 935.9 eV)及卫星峰，表明部分氧化；Ag 3d_5/2位于368.2 eV对应金属Ag?，3d双峰裂距6.0 eV。

Contact angle and surface free energy（接触角与表面自由能）

纯SF垫水接触角33.46°，偏亲水。负载酚酸后润湿性变化各异：CA与RA使接触角略升；EA使水接触角略降至31.3°但二碘甲烷接触角升至58.88°。SF_Ag NPs_EA组水接触角反常升高至98.95°，归因于EA通过邻苯二酚羟基与Ag配位使其亲水基朝内、芳香疏水环朝外，加之SF向β-折叠转变共致表面疏水。Cu NPs系列中SF_CuNPs_RA水接触角低至17.77°，SF_CuNPs_EA水接触角18.16°，显示强亲水性。

Nanoparticles release profiles（纳米颗粒/离子释放曲线）

SF_Ag NPs_1h（低载量）24 h释出17.94% Ag?与2.10% Ag NPs，1周达62.79% Ag?而NPs释放不增，表明NPs结合牢固。SF_Ag NPs_2h（高载量）24 h释84.47% Ag NPs。Cu NPs垫缓慢持续释放Cu2?与Cu NPs。Ag/Cu共溅射垫Ag?释放较单Ag垫更快。低载量Ag NPs垫因可控离子释放且NPs不脱落被视为更理想。

Thermal properties - TG and DSC analysis（热性能—TG与DSC分析）

TG-DTG显示四段失重：<130℃为吸附水挥发；~130–250℃仅CA组见失重（CA脱羧）；250–380℃与380–450℃为SF肽键及β-折叠碳化成。含EA或RA的垫热稳定至250℃，优于含CA者。DSC见~280℃为SF无定形区降解吸热峰，>370℃为β-折叠最终碳化放热峰；CA组额外130–200℃脱羧峰。EA组热稳定性最高。

Biological activity in vitro（体外生物活性）

Antibacterial activity（抗菌活性）：CA、RA、EA对S. aureus GFP的MIC分别为2.5 mg/mL、2.5 mg/mL、0.3 mg/mL；FICI测试显示CA+EA协同(FICI=0.25)，CA+RA相加(FICI=0.75)，RA+EA无关(FICI=1)。SEM观察MIC浓度下CA与RA致S. aureus细胞壁凹陷穿孔，EA处理见细胞外囊泡样结构。敷料对B. paramycoides和E. coli无明显抑菌圈（间接作用弱），但直接接触区生长受抑；含Ag NPs或Ag/Cu NPs垫接触抑菌明显，辅以CA或RA增强效果，低载Ag NPs+CA(SF_Ag NPs_CA)与低载Cu NPs+CA(SF_Cu NPs_CA)亦见完全抑制接触区细菌生长，EA单独或组合未见显著额外抗菌增强但细胞毒性最低。

Cytotoxicity in vitro（细胞毒性）：HaCaT细胞在多数垫上培养3天相对增殖率>70%（符合ISO 10993-5），证明细胞相容性；SF_CA、SF_Ag NPs_CA、SF_Ag NPs_RA及SF_Ag/Cu NPs_CA/EA增殖降至约50%，提示中度毒性关联离子释放。ROS检测RA修饰组氧化应激最强，Ag NPs各组ROS高于对应Cu NPs组。线粒体膜电位(JC-10红/绿比)显示含EA组(SF_EA、SF_Ag NPs_EA、SF_Cu NPs_EA)几无MMP下降，而其他组见MMP去极化，说明EA修饰垫对细胞线粒体功能干扰最小。

讨论与结论翻译

研究表明，通过组成调控可明确影响无机-有机杂化纳米纤维垫的润湿性与热学性质。含鞣花酸(EA)的纤维热稳定性最高，金属NPs对热性影响可忽略。优化工艺获结构均一垫，体外生物响应可重复。含Ag NPs与酚酸（CA或RA）垫抗菌最强但细胞毒性高于含EA对应垫（EA MIC最低）。酚酸在生物活性中起主要作用，同时降低对应NPs释放离子的细胞毒性效应；两种酚酸联用未见增效，说明酚酸与缓释金属离子的联合作用对确保抗菌兼细胞相容性至关重要。综合所有结果，研究人员选定SF_Ag NPs_EA作为兼具抗菌活性与细胞相容性的最优杂化纳米复合材料。

综上，静电纺丝丝素蛋白纳米纤维负载金属纳米颗粒及酚酸是有前景的生物相容性生物材料，可用于伤口愈合、组织工程、食品包装及美容产品等领域。无机-有机杂化设计可减少抑菌金属NPs用量，通过多靶点作用机制降低微生物产生耐药的风险；酚酸添加与金属离子控释保证了基于多重生化通路激活的增强抗菌响应。