《Natural Product Reports》：Decision making by modular polyketide synthases and implications for genetic engineering
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模块聚酮合酶（PKSs）常被描述为分子水平的装配线——这一称号暗示了高度协调和受调控的活性。然而，所有这些系统都必须应对若干关键的生物合成"选择"以忠实地产出一种或有限数量的产物。这些替代选择发生在装配过程的所有阶段，包括构建单元选择、链延伸、亚基间转移、反式
模块聚酮合酶（PKSs）常被描述为分子水平的装配线——这一称号暗示了高度协调和受调控的活性。然而，所有这些系统都必须应对若干关键的生物合成"选择"以忠实地产出一种或有限数量的产物。这些替代选择发生在装配过程的所有阶段，包括构建单元选择、链延伸、亚基间转移、反式作用酶的修饰以及链终止。研究人员在此讨论了数十年来为阐明支撑PKS生物合成保真度的详细且往往惊人复杂的分子机制所开展的研究。这些洞见激发了通过遗传工程在这些决策点进行干预以将途径重定向至替代结果及其相关新产物的日益有效的努力。
1. 引言
还原型或复杂的聚酮天然产物经常激发合成化学家尝试其全合成，往往导致需要数十种化学试剂的多步方案。然而细菌能够以强健的催化、能量和原子效率，从有限的简单前体库构建这些高度复杂的分子。与实验室方法中复杂亚结构先合成再同系化连接不同，自然界以线性方式、逐块构建聚酮。虽然基本算法简单，但所得链的结构多样性源于每个单体进入过程时的精细定制等因素。
在此背景下，值得思考大自然可能使用何种酶学来程序化这一系列修饰。一种可能是将细菌脂肪酸生物合成中的酶用于构建聚酮，因为底层化学相同。为组装脂肪酸，乙酰-CoA起始单元与连接于非催化酰基载体蛋白（ACP)丙二酸延伸单元缩合，通常由酮脂酰合成酶（KAS III)同源物（FabH)催化。产生的β-酮链随后依次被酮脂酰还原酶（KR; FabG)、脱水酶（DH; 如FabZ)和烯酰还原酶（ER; 如FabI)作用，分别产生β-羟基、烯烃和完全还原的中间体。该循环反复进行（KS FabB和FabF接替FabH)直至达到适当链长（通常为C16)。虽然原则上可以重定向该途径来制造聚酮，但这需要程序化的加工反应短路以产生这些分子特征性的多样化功能，这解释了为什么大自然没有选择这种模式来制造复杂聚酮。
相反，大自然采用劳动分工的方法来构建复杂聚酮，其中途径中的每一步都由专用酶结构域执行。以红霉素A核心（6-脱氧红霉内酯B, 6-dEB)的组装为例，它由一分子丙酰-CoA起始单元和六分子其羧化等价物(2S)-甲基丙二酰-CoA作为延伸单元构建。该系统因此包含7个能够从这些细胞库中选择单体的酰基转移酶（AT)结构域。将它们连接在一起需要六个碳-碳键——由六个KS结构域完成（KS和AT结构域一起被称为系统的"缩合翼"部分）。该途径还精确整合了设置大环侧链功能基团所需的酶组：六个KR（其中一个KR0不催化酮还原，仅催化α-甲基位置的差向异构化)、一个DH和一个ER。最后，链作为大环内酯的关键释放由硫酯酶（TE)结构域完成。
与脂肪酸生物合成类似，底物和中间体在整个过程中通过其磷酸泛酰巯基乙胺（Ppant)辅基连接到ACP上。这种栓系使链能够被引导至所有催化伙伴，考虑到强制性、延伸的反应序列，这一特征具有明显的动力学优势。结构域集合被组织成功能模块——一个用于启动生物合成（通常为AT-ACP)和六个用于链延伸（最低限度包含KS、AT和ACP结构域，并包含可变组合的加工活性）。这些模块分布在多个称为亚基的巨型多肽中（如DEBS 1、2和3），它们按作用顺序线性排列，形成构建聚酮小分子的真正分子规模装配线，即模块聚酮合酶（PKS)。这些酶
的另一个重要特征是其强制性同源二聚体特性，其中KS、DH和TE结构域等贡献于二聚化。迄今已鉴定出两大类模块PKS——cis-AT类，其中AT存在于多酶内部；以及trans-AT类，其中该功能由离散酶提供，迭代地服务所有PKS模块。
装配线生物合成逻辑巧妙地解决了聚酮生物合成中固有的某些问题——哪个酶做什么以及何时做——但它又创造了其他问题。如果假设这些系统进化为合成一种或最多几种相关结构，那么每个PKS必须在多个存在替代结果的决策点进行协调。本综述讨论模块PKS如何处理这些生物合成"选择"，以及它们为通过遗传工程修饰结构以产生新衍生物提供的机会。
2. 构建单元的选择（起始/延伸单元）
2.1. cis-AT PKS AT的底物/ACP伙伴选择
聚酮生物合成的第一个决策点是选择构建链的单体。给定PKS系统可能在细胞环境中遇到广泛的酰基-CoA，包括初级代谢产生的和那些由簇特异性酶产生的。常见起始单元包括乙酰-CoA和丙酰-CoA，而羧化等价物丙二酰-CoA和(2S)-甲基丙二酰-CoA是最常见的延伸单元。还包括更特殊的物种如氨基酸衍生的异丁酰-CoA和2-甲基丁酰-CoA（如阿维菌素中)，以及胍基丁酰-CoA（如阿唑霉素F中)。额外的非典型前体在ACP载体上由簇编码的酶组组装。
单体选择通常由AT结构域完成。在这种情况下，选择反应分两步进行（即乒乓机制）：AT首先以底物对其活性位点丝氨酸进行自我酰化，然后将构建单元转移至ACP受体的Ppant臂。AT的较大催化亚结构域展现蛋白酶特征性的αβ水解酶折叠，但已进化为将酰基-酶中间体转移至与其形成复合体的下游ACP结构域。分子动力学（MD)模拟表明，较小的附加铁氧还蛋白样亚结构域有助于确定活性位的总体体积和流动性，并帮助定向ACP以结合催化部分。AT催化装置包括上述与保守His残基形成催化二联体的Ser（主链NH可能作为三联体的第三个成员），以及由主链酰胺残基组成的氧阴离子空穴。
2.2. trans-AT PKS AT的底物/ACP伙伴选择
关于trans-AT PKS的AT，这些酶中的大多数选择丙二酰-CoA作为底物，但少数特异性针对替代构建块的AT也已被表征。这些AT可能在这些系统中以离散蛋白形式存在，或以多结构域蛋白中的结构域形式存在（如串联AT、AT-ER、AT-AT-ER等)。有趣的是，大多数离散AT与cis-AT PKS的AT分支不同，更接近细菌脂肪酸合成中的酶（它们也是丙二酰-CoA特异性的），但乙基丙二酰-CoA特异性的KirCII例外，它更类似于cis-AT PKS的AT。
2.3. 单体选择的工程改造
在阐明了参与介导AT底物选择（包括待转移的小分子及其载体（CoA或ACP)，以及目标PKS ACP结构域）的序列元件后，原则上可以通过靶向工程改造来操纵这些特异性。该方法的优点在于最小化扰动AT结构及其与顺式或反式其他结构域相互作用界面的风险。在此背景下，大量努力已投入到通过定点突变改变cis-AT PKS中的延伸单元选择。虽然这些实验已产生修饰的特异性，但尚未实现底物选择的完全转变。此外，它们总是伴随着催化效率的丧失。
目前已探索的两大主要策略包括：交换整个不同特异性的AT结构域；以及AT结构域失活与反式互补相结合。AT结构域交换已成为数十年的首选工程策略，因为至少理论上，结构域本身的结构改变应最小化。然而，关于交换实验所用位点的选择始终存在考量。
3. 应对cis-AT和trans-AT PKS中的模块内/间选择
一旦起始单元或生长的聚酮被加载到特定模块的KS结构域上，KS催化的克莱森型缩合就可以发生在底物和ACP栓系的延伸单元之间。这种同系化反应产生连接在ACP上的β-酮中间体。此时，每个PKS模块必须做出关键决定：是将链转运至模块内的全套加工酶，还是将中间体转移至下游结构域（通常为KS，或在PKS末端为TE结构域）。换句话说，必须在模块内和模块间相互作用之间做出选择。
对于cis-AT PKS，支持中间控制模型的数据已通过X射线晶体学和冷冻电镜以高分辨率解析两种完整模块的结构获得。一个模块来自负责红霉素A生物合成的原型PKS系统（DEBS模块1)，第二个来自拉沙洛西德A装配线（Lsd14)。关键使能方法是通过使用称为Fab 1B2的抗原结合片段来稳定结构的同源二聚体KS-AT双结构域部分，从而降低模块的高构象异质性。
对于trans-AT PKS，结构数据相对稀少。与该关键决策点相关的唯一信息是通过冷冻电镜以高分辨率获得的来自短芽孢杆菌孤儿BGC11 PKS的"双模块核心"。
4. 一次性使用与迭代模块
4.1. 迭代的分子基础
与假定的模块PKS脂肪酸合酶祖先的迭代作用不同，大多数PKS模块在任何给定底物上仅执行一轮链延伸/加工后将其送至下游。这种生长模式被称为"定向"或"矢量"合成，同样取决于完成一轮完整裁剪反应后的关键选择：将聚酮递交给下游模块而非送回上游KS进行进一步链延伸。
然而，这两个模型都无法解释在其他模块化PKS背景下存在多种天然迭代模块的发现。cis-AT PKS中这类有趣的模块化/迭代系统包括：ambruticin、stigmatellin、aureothin/neoaureothin、DKxanthenes、borrelidin、crocacin、thiolactomycin和azalomycin/kanchanamycin等，而trans-AT PKS如9-甲基strepimidone、patellazole、NOCAP、gladiolin/etnangien和lankacidin/chejeunolide也表现此行为。
表征DKxanthene PKS中的迭代揭示了促进迭代的另一特征。如上所述，大多数重复模块在亚基连接处运作，因此中间体向下游模块的转移取决于与下一个多肽的特定蛋白质-蛋白质相互作用。相反，如果亚基结合是次优的，则ACP到KS的回传可以在动力学上胜过向下一模块的链易位。
4.2. 迭代系统的工程改造
就迭代系统的遗传工程而言，迄今为止努力相对有限。一个值得注意的例子是在体外检测中探测模块迭代，明确目标是将一次性使用模块（DEBS模块3)转化为重复系统。最广泛的体内工作是在neoaureothin cis-AT PKS上进行的，旨在探索迭代模块的可塑性。
5. 下游模块/亚基伙伴的时机与选择
5.1. 模块间界面处的作用因素
完成完整链延伸周期和所需裁剪反应后，链延伸中间体必须转移至下游模块以进行额外轮次的生长，或转移至末端TE/链释放结构域。对接结构域（DDs)是确保此类连接处链易位保真度的三个不同要素之一。DD是位于cis-AT和trans-AT PKS亚基极端C端和N端的10-80残基长的蛋白质-蛋白质识别基序。cis-AT PKS的第一个重要观察是大多数已表征的DD包含1-3个α-螺旋。最近显示，结构上等同的DD可以以几种不同方式部署以形成拓扑分歧的DD复合体。
第二个促成伙伴选择性的因素涉及上游亚基的供体ACP结构域与受体亚基中结构域（包括直接转酰基的KS)之间形成生产性相互作用。最近，通过化学交联首次可视化了模型对接界面。
关于KS底物选择的分子基础，对于trans-AT PKS，KS序列的系统发育与α和β位置的进入中间体结构之间存在强相关性——即KS与上游模块中共同设定这两个功能性的修饰结构域套件协同进化。
5.2. 亚基间相互作用的工程改造
PKS模块的固
有复杂性和高结构域相互依赖性强烈主张在遗传工程中使用整个模块作为生物合成单元，作为结构域交换的补充。然而，这种方法需要准确定义PKS"模块"的含义。
几十年来，PKS模块被定义为链延伸所有步骤所需的最低结构域集合——选择构建单元、将选定单体转移至ACP结构域、以及链延伸——并包含可选的加工结构域。传统PKS模块因此包含KS-AT-修饰结构域-ACP。然而，某些KS（最显著的是trans-AT PKS的KS)与上游修饰结构域共同进化的事实，促使人们争论将PKS模块"重新定义"为从AT结构域开始并在下游KS之后终止（即AT-修饰结构域-ACP-KS)。
无论采用何种策略（经典模块与XU/XUA相比)，基于模块的工程改造总是在所得系统中产生一个或多个非天然元素。另一种相关方法是在现有PKS多肽的模块之间插入对接结构域以创建新的亚基间相互作用。
6. 反式作用酶的选择
6.1. cis定位的跨模块ER反式作用
在azalomycin（Azl)的cis-AT PKS组装过程中， housed在第一迭代模块（称为模块1/2)中的ER结构域以跨模块方式作用于模块3的ACP（ACP3)上栓系的中间体。这种反式作用是必要的，因为模块3产生α,β-饱和中间体但缺乏ER结构域。
6.2. 反式作用ER GbnE对模块/迭代行为的调节
如前所述，招募反式作用的ER GbnE到gladiolin PKS的模块5抑制了该模块的固
有迭代倾向。
6.3. trans-AT PKS系统中的反式作用α-羟化酶
聚酮中间体的在线α-羟基化迄今已在oocydin和mupirocin两种trans-AT PKS中研究。在oocydin案例中，该反应由黄素依赖性单加氧酶同源物OocM催化，发生在模块4（OocL KS4-KR4-ACP4)和模块5（OocN KS0-ACP5)之间的亚基连接处。
6.4. β-甲基化组件的选择
β-修饰是trans-AT PKS中常见的在线转化，但在cis-AT系统中较少见。尽管化学上β-甲基简单，但其安装需要五种不同蛋白质的"组件"：离散ACP（称为ACP供体, ACPD)、缩合无活性但脱羧的KS同源物（KS0)、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶（HMGS)同源物，以及两个烯酰-CoA水合酶同源物（ECH1和ECH2)。
在virginiamycin（Vir)案例中，β-甲基化历史上被认为仅在模块5的链延伸过程中发生。surprisingly, 通过该系统的各种工程改造，可以实现不同β-甲基化模式的调控。
6.5. 通过反式ECHQ-TE双结构域重编程PKS
Bacillus subtilis的aurantinins（ARTs)是通过偶联长链和短链聚酮产生的，分别由12个延伸模块（Art10-Art15)和双模块（Art16)trans-AT PKS合成。除参与第三和第四链延伸周期β-分支的经典ECH1（Art19)和ECH2（Art20)外，该途径还包括Art21，一种涵盖第二个ECH2同源物与校对硫酯酶（TEII)融合的蛋白质。
7. 终止PKS基础的组装
7.1. II型酶链释放的酶学
在线校对的需求假设来自罕见的KS催化的、在缺乏链延伸中间体情况下ACP栓系延伸单元的脱羧。这一异常活性将导致ACP结构域上连接类似起始单元的产物。其他潜在的错误来源包括PPTase催化的磷酸泛酰巯基乙胺化过程中使用酰基-CoA替代CoA导致酰化ACP、加载模块的构建单元错选、以及链延伸中间体的错加工。
对多个cis-AT PKS系统的研究已鉴定了专门的水解释放这些异常底物的独立TEIIs。当这些酶被选择性失活时，产物产量通常下降，但活性可以通过互补恢复。催化分两步进行，初始为TE活性Ser的自我酰化（即反式酰化)，随后是水介导的释放。
7.2. I型TE和其他酶的链释放
一旦PKS催化的链组装完成，产物需要从多酶释放，然后进行所谓的后PKS酶处理。这种化学通常由最终PKS亚基的C端结构域以顺式完成，尽管并非总是如此。I型TE是最常见的酶，但已报道多种其他可能性，包括I型TE的硫酯还原酶（TR)结构域的还原释放或相反通过氧化机制，以及II型TEs的水解。
由于TE是代表性的卸载结构域，本讨论的其余部分将聚焦这些催化剂。已从cis-AT PKS来源的多种TE通过X射线晶体学以高分辨率表征，以理解初始底物选择和链释放模式的基础。综合这项工作揭示，同源二聚体TE展现总体典型的αβ-水解酶三级折叠，但非典型地包含贯穿整个蛋白质的底物通道，其结构完整性取决于二聚体形成。
7.3. 释放机制的工程改造
许多已发表的例子中，TE结构域通过遗传工程用非天然底物进行挑战，要么通过将其重新定位到同一系统中的替代位置，要么通过改变其相关PKS，或将结构域移植到异源装配线中。这些实验的高成功率与酰化半反应的通常广泛特异性相关，在重新定位实验的情况下，与明确的ACP/TE界面的缺失相关。
一项有吸引力的替代修饰TE选择的方法是改变链释放的基础化学。该策略最近被用于使用工程双模块PKS产生小分子醇，通过将它们与异源TR结构域栓系。在众多测试的融合策略中，最高产量是在TR与其天然上游ACP伙伴一起引入时实现的，使用ACP结构域N端的位点。
8. 结语/展望
本综述表明，多种复杂的、多层机制支撑着模块PKS系统导航聚酮组装过程中众多选择的能力，尽管并不完美。这类控制过程通常通过单个ACP及其结构域/酶伙伴的特定结构特征运作，但 additionally通过它们的相互作用，以及在多结构域、整个模块和多模块水平上运作。虽然对这些元件的理解已大幅推进，但仍有大量待发现之处。值得注意未解决问题包括：ACP被反式作用伙伴酶反选择的基础；现有模块内与模块间决策点控制模型是否适用于增强结构域组成的cis-AT PKS模块以及trans-AT PKS模块；某些模块固有迭代倾向的分子特征及其仅在选定周期部署加工结构域的能力；观察到的模块间界面ACP/KS对接相互作用的普遍性；KS底物特异性的氨基酸基础；以及TE底物选择和释放模式可通过定点突变和定向进化方法影响的程度。预期未来对这些问题的研究将增强我们合理操纵这些关键决策点的能力，进一步使PKS途径重定向至新类似物合成的持续努力成为可能。
模块聚酮合酶（PKSs）作为分子装配线，在复杂天然产物生物合成中面临多重决策点，包括构建单元选择、链加工与转移、模块迭代行为调控、亚基间通讯以及终产物释放等关键步骤。本综述系统阐述了这些决策点的分子机制及其在遗传工程中的应用前景。
在构建单元选择方面，酰基转移酶（AT)结构域通过特异性识别起始单元和延伸单元决定聚酮链的基础骨架。对于cis-AT系统，AT结构域通常具有严格的底物选择性，其分子基础涉及活性位点口袋的大小、形状以及关键的氨基酸残基基序。近年研究通过结构生物学手段揭示了AT与ACP相互作的精细机制，为通过结构域互换或互补策略改造单体选择性提供了理论基础。trans-AT系统则展现了不同的组织方式，其离散AT酶通常迭代地服务多个模块，且ACP识别模式与cis-AT系统存在显著差异。
链延伸后的加工与转运决策涉及模块内和模块间的动态协调。新近的高分辨率结构研究揭示了完整PKS模块存在多种构象状态，ACP结构域在其中的空间定位受到模块整体构象的精密调控。"旋转门"模型和"摆锤"模型分别从不同角度解释了ACP如何被引导至正确的催化伙伴，避免过早的链转移。工程实践中，模块内结构域的交换往往因破坏精细的界面相互作用而导致效率下降，提示整个模块作为功能单元进行互换可能更为可行。
模块迭代行为的调控是产生结构多样性的重要机制。天然存在的迭代模块通常在亚基连接处运作，其重复催化能力受多种因素影响：模块固有的迭代倾向、下游KS的门控作用以及亚基间相互作用的效率。通过在体外重构系统中对ACP结构域进行工程改造，研究人员成功将一次性使用模块转化为迭代模块，但产物控制的精确性仍有待提高。
亚基间链转移需要对接结构域（DDs)、兼容的结构域/结构域界面以及受体KS底物特异性三重保障。DD作为蛋白质-蛋白质识别基序，在不同PKS系统中演化出多种互作模式，且可通过合成生物学手段进行人工设计。然而，KS守门员效应仍然是模块互换中的主要瓶颈，受体KS对非天然底物的低耐受性常导致工程化途径效率低下。
反式作用酶的精确调控进一步拓展了聚酮结构的化学空间。α-羟基化、β-甲基化等修饰由特定酶组件催化完成，其底物选择性源于ACP识别、底物结构识别以及反应竞争动力学的综合作用。以β-甲基化为例，不同trans-AT系统中调控策略存在显著差异，从严格的ACP依赖识别到以HMGS为唯一关卡的不同模式，反映了这类修饰在不同进化背景下的独立起源。
终产物释放阶段，I型TE结构域通过其特征性的底物通道控制大环内酯化与水解的化学选择。TE活性位点的尺寸、形状和化学环境决定了产物的最终结构，而近期通过理性设计和定向进化对TE进行工程改造已取得显著进展，如活性位点Ser→Cys突变可拓宽底物适用范围。此外，用TR结构域替代TE实现还原性释放，为生成新型聚酮骨架提供了新的工程策略。
综上，模块PKS的多层次决策机制体现了生物合成途径在进化过程中的精细优化。深入理解这些机制不仅有助于解释天然产物的结构多样性来源，更为理性设计和改造聚酮生物合成途径以获取新型活性分子奠定了理论基础。
