《Neurobiology of Disease》：Loss of astrocytic markers and impaired metabolic function in spinocerebellar ataxia type 7 patient-derived neural cultures
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第七型脊髓小脑性共济失调（spinocerebellar ataxia type 7, SCA7）是一种由ATXN7基因中CAG重复扩增引起的罕见神经退行性疾病。该重复扩增导致Ataxin-7蛋白中异常长的多聚谷氨酰胺（polyglutamine, PolyQ
第七型脊髓小脑性共济失调（spinocerebellar ataxia type 7, SCA7）是一种由ATXN7基因中CAG重复扩增引起的罕见神经退行性疾病。该重复扩增导致Ataxin-7蛋白中异常长的多聚谷氨酰胺（polyglutamine, PolyQ）链。这最终导致最显著的浦肯野细胞（Purkinje cells）和视网膜细胞（retinal cells）的变性。由于没有能够阻止或减缓疾病进展的治疗方法，因此迫切需要患者特异性疾病模型来揭示新的致病机制并进行治疗测试。在本研究中，研究人员将来自健康对照和SCA7个体的诱导人多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）分化为由神经元和星形胶质细胞组成的混合神经细胞群。尽管对照和SCA7神经元在形态上相似，但SCA7来源的星形胶质细胞表现出星形胶质细胞特异性标志物胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）和S100钙结合蛋白B（S100 calcium-binding protein B, S100B）的显著丢失。转录组分析揭示了与胶质细胞分化、细胞代谢和氧气处理、蛋白质稳态以及神经元分化和神经元信号传导相关的基因发生实质性改变。线粒体应激试验进一步证实了SCA7神经细胞中的线粒体表型。总之，这些发现表明，hiPSC来源的神经细胞提供了一个可用于研究SCA7疾病机制和测试潜在治疗方法的稳健平台。
**研究背景与问题**
第七型脊髓小脑性共济失调（SCA7）是一种罕见的常染色体显性遗传神经退行性疾病，由ATXN7基因第3外显子CAG重复扩增引起，导致Ataxin-7蛋白中多聚谷氨酰胺（PolyQ）链异常延长。患者主要表现为小脑共济失调和视力丧失，目前尚无阻止或减缓疾病进展的疗法。现有动物模型无法完全重现患者特异性遗传背景和疾病表型，因此迫切需要患者特异性疾病模型来揭示新致病机制并测试潜在治疗策略。以往研究提示SCA7中存在星形胶质细胞病理表型和线粒体功能障碍，但基于人诱导多能干细胞（hiPSC）的体外模型尚缺乏对星形胶质细胞和代谢功能的深入分析。
**研究内容与结论**
研究人员将来自两名SCA7患者（CAG重复10/60和11/59，均为儿童期发病）和两名健康对照的hiPSC分化为包含神经元和星形胶质细胞的混合神经细胞群。通过免疫荧光、定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）、全转录组测序、Seahorse线粒体应激试验和ATP检测等方法分析细胞表型。结果表明：SCA7神经元形态与对照相似，但星形胶质细胞显著丢失特异性标志物GFAP和S100B；转录组分析揭示胶质细胞分化、细胞代谢与氧气处理、蛋白质稳态以及神经元分化与信号传导相关基因广泛失调；线粒体呼吸功能受损，表现为基础呼吸、最大呼吸、备用呼吸能力、ATP产生及非线粒体耗氧量均降低，并伴随线粒体基因表达下调。这些发现证实该hiPSC源性神经细胞模型可复现疾病相关表型，为研究SCA7机制和治疗筛选提供了稳健平台。该论文发表在《Neurobiology of Disease》。
**主要关键技术方法**
本研究使用来自莱顿大学医学中心（LUMC）伦理批准的hiPSC系（SCA7患者CAG重复长度67、61、64；对照为10/10）。关键方法包括：1) hiPSC分化为神经前体细胞（NPC）并进一步成熟为混合神经细胞；2) 免疫荧光染色结合CellInsight高内涵筛选平台定量神经元（MAP2、TUBB3）和星形胶质细胞（GFAP、S100B）；3) RT-qPCR验证基因表达；4) 全转录组测序（NovaSeq 6000）进行差异表达基因和基因本体（GO）富集分析；5) Seahorse XF线粒体应激试验测量氧耗率（OCR）；6) 荧光素酶ATP检测试剂盒定量ATP水平。
**研究结果**
**3.1 生成hiPS细胞源性的SCA7神经培养物**
通过MiSeq确认SCA7 hiPSC系携带扩增CAG重复（67、61、64）。所有系均成功分化为NPC并进一步成熟为混合神经细胞。RT-qPCR显示SCA7细胞ATXN7转录水平显著高于对照，免疫荧光显示Ataxin-7蛋白主要定位于核内，未见蛋白聚集。
**3.2 SCA7神经元表现出与对照相当的神经元分化和形态**
免疫荧光和定量分析显示SCA7与对照的MAP2和TUBB3阳性神经元比例相似，神经元胞体数、神经突总数和总长度无差异，但SCA7神经元分支点数显著减少。
**3.3 星形胶质细胞特异性标志物GFAP和S100B丢失**
免疫荧光和定量分析显示SCA7培养物中GFAP阳性细胞较对照减少53倍，GFAP转录水平降低43倍；S100B阳性细胞和转录水平也显著降低，但程度较轻。结合神经元数量不变，提示星形胶质细胞仍存在但标志物表达下降。
**3.4 比较转录组分析识别SCA7与对照神经细胞间的差异基因表达**
全转录组测序共鉴定349个差异表达基因（197个上调，152个下调）。上调基因包括突触组织相关基因（如RIMBP2、SST、PTPRT）和神经元分化基因（如FOXG1、HOPX）；下调基因包括神经元分化（如NEUROG2、SNCA）、代谢（如ABHD6、FASN）等基因。RT-qPCR验证了6个基因中的5个表达趋势一致。
**3.5 转录组分析揭示胶质细胞、代谢与氧气处理、蛋白质稳态及神经元信号相关基因表达改变**
GO富集分析显示SCA7细胞中上调的生物学过程涉及神经元发育、轴突导向和突触形成（如ROBO3、UNC5D）；下调过程包括神经元分化（如NEUROG2、NEUROD2）、胶质细胞发育（如GFAP、ROR2）、代谢与氧气响应以及蛋白质稳态。分子功能分析显示上调过程与神经元兴奋性和离子通道活性相关，下调过程与转移核糖核酸（tRNA）活性相关。免疫荧光验证显示SCA7神经元中γ-氨基丁酸（GABA）和突触素（Synapsin）阳性细胞减少，RT-qPCR显示GAD1和SLC17A7表达下降。
**3.6 SCA7细胞中线粒体呼吸功能受损**
Seahorse检测显示SCA7神经前体细胞（NPC）线粒体呼吸无显著差异，但在成熟神经细胞中基础呼吸、最大呼吸、备用呼吸能力、ATP产生和非线粒体耗氧量均显著降低。荧光素酶ATP检测确认SCA7细胞ATP水平下降。转录组数据显示线粒体基因（如MT-ATP6、MT-ND4L、MT-CO3等）表达普遍降低。
**讨论与结论**
讨论部分指出，SCA7星形胶质细胞标志物GFAP和S100B的缺失并非由于细胞死亡（神经元比例不变、其他星形胶质细胞标志物如VIM、SOX9未改变），而是提示成熟或反应性星形胶质细胞分化延迟。这是首个在hiPSC源性SCA7模型中报道星形胶质细胞缺陷的研究，支持胶质细胞在SCA7发病机制中的作用。转录组中下调的成熟神经元标志物与上调的早期神经元分化基因表明SCA7神经元处于较不成熟状态，神经元信号传导缺陷（如分支减少、GABA和突触素降低）可能因星形胶质细胞支持不足而加剧。代谢通路和线粒体功能下降与既往SCA7小鼠和患者数据一致，但仅在成熟神经细胞而非NPC中观察到，提示表型具有细胞类型和CAG长度依赖性。线粒体缺陷可能源于SAGA复合物功能障碍或蛋白聚集效应。研究局限性包括未分化直接受影响的浦肯野细胞和感光细胞，且模型相对幼稚（SCA7通常为成年发病）。结论部分翻译如下：尽管SCA7 iPS源性神经元形态上与对照神经元相似，但星形胶质细胞表现出成熟星形胶质细胞特异性标志物的丢失。RNA测序揭示了SCA7与对照神经培养物之间的显著转录组差异，最显著的变化发生在与胶质细胞分化、代谢与氧气处理、蛋白质稳态以及神经元分化和突触传递相关的基因中。多种检测进一步证实了SCA7神经细胞中的线粒体功能障碍。尽管本研究未将hiPSC分化成SCA7中最受累的细胞类型（即浦肯野细胞和感光细胞），但SCA7小鼠模型和患者中也报道了其他神经细胞群体的丢失。此外，iPS源性神经细胞本质上是一个不成熟的模型，而SCA7通常表现为成年发病的疾病。尽管存在这些局限性，SCA7神经培养物展现出疾病相关表型，因此为阐明新疾病机制和筛选潜在治疗策略提供了有价值的平台。
