综述：人源TDP-43表达加重颗粒蛋白前体不足小鼠的额颞叶痴呆相关表型

《Neurobiology of Disease》：Human TDP-43 expression worsens FTD-related phenotypes in progranulin-insufficient mice

　　

颗粒蛋白前体（progranulin, GRN）功能缺失突变可导致伴TDP-43病理的额颞叶痴呆（frontotemporal dementia with TDP-43 pathology, FTD-TDP）。几乎所有致病性GRN突变均引起颗粒蛋白前体单倍剂量不足，但其导致FTD-TDP的具体机制尚不清楚。为探究该问题，研究人员将颗粒蛋白前体不足小鼠与人源TDP-43转基因小鼠系（RRID:IMSR_JAX:012836）进行杂交，该转基因小鼠系中纯合子（hTDP++）在幼年即可形成TDP-43聚集体，而半合子（hTDP+）则不产生TDP-43聚集体。因此，研究同时分析了颗粒蛋白前体不足对hTDP+和hTDP++小鼠的影响。结果显示，颗粒蛋白前体不足未在hTDP+小鼠中诱导TDP-43聚集，但与hTDP表达存在交互作用，可加重FTD相关表型。GRN+/?:hTDP+小鼠的社会支配能力损伤较单独的GRN+/?或hTDP+小鼠更为显著，这与颗粒蛋白前体不足和hTDP表达对内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex, mPFC）神经元树突棘的联合效应相关。尽管无TDP-43聚集发生，颗粒蛋白前体不足仍改变了hTDP+小鼠额叶皮层中由hTDP过表达诱导的RNA剪接事件。此外，颗粒蛋白前体不足未改变hTDP++小鼠的TDP-43聚集水平，但GRN?/?:hTDP++小鼠表现出异常神经炎症反应，其特征为疾病相关小胶质细胞标记物升高及适应性免疫反应受损迹象。上述结果提示，mPFC神经元功能障碍可能是FTD-GRN行为改变的潜在机制，而炎症失调可能是FTD-GRN疾病进展的关键驱动因素。

引言

GRN杂合功能缺失突变通常导致颗粒蛋白前体单倍剂量不足，进而引发额颞叶痴呆（frontotemporal dementia, FTD）。FTD-GRN的病理特征为伴TDP-43病理的额颞叶变性A型（frontotemporal lobar degeneration with TDP-43 pathology type A, FTLD-TDP type A），其核心表现为TDP-43从细胞核向细胞质错位并形成聚集体。TDP-43蛋白病可直接介导神经退行性变，病理型TDP-43可能具有神经元毒性，同时核内TDP-43耗竭可通过功能缺失效应干扰RNA表达与剪接。GRN突变被认为通过颗粒蛋白前体单倍剂量不足诱发FTLD-TDP，几乎所有已知致病性GRN突变携带者的血液与脑脊液中颗粒蛋白前体水平均降低约50%。支持这一假说的研究显示，部分颗粒蛋白前体不足的诱导多能干细胞来源模型表现出与TDP-43蛋白病一致的特征；颗粒蛋白前体不足小鼠可模拟FTD-GRN的部分表型，GRN^+/?或携带FTD致病突变敲入的小鼠可出现FTD相关行为缺陷但无典型病理改变，GRN^?/?及GRN^R493X/R493X小鼠则可模拟FTD-GRN的神经炎症特征，但在老年阶段仅出现轻度神经元丢失及丘脑、脑桥区域的TDP-43蛋白病。目前关于颗粒蛋白前体不足如何导致FTLD-TDP的机制尚不明确，现有实验模型提示多种可能性：颗粒蛋白前体是维持溶酶体功能的关键分子，GRN纯合突变导致的完全蛋白缺失可引起神经元蜡样脂褐质沉积症（neuronal ceroid lipofuscinosis, NCL）；FTD-GRN患者存在溶酶体功能损伤迹象，可能促进颗粒蛋白前体不足神经元中病理型TDP-43的累积；此外，患者受累脑区存在神经炎症，这一现象也在GRN^?/?小鼠中被复现，可能参与TDP-43病理的发生发展。然而，颗粒蛋白前体不足小鼠的神经元退变与TDP-43病理程度有限，限制了其在FTD-GRN机制研究中的应用。为深入探究颗粒蛋白前体不足导致的TDP-43调控异常，研究人员将颗粒蛋白前体不足小鼠与人源TDP-43（human TDP-43, hTDP）转基因小鼠系进行杂交，该系小鼠在Thy1启动子下表达野生型人源TDP-43，其中半合子（hTDP+）的hTDP-43表达水平与内源性Tardbp相当，无明显表型且不形成TDP-43聚集体；纯合子（hTDP++）的hTDP-43表达量约为内源性的两倍，可在运动皮层与体感皮层形成TDP-43聚集体并伴随严重神经炎症。通过分析hTDP+与hTDP++小鼠，研究旨在明确颗粒蛋白前体不足是否能诱导或加重TDP-43聚集及相关表型，并对GRN:hTDP小鼠的FTD相关行为与病理特征进行了系统表征。

方法

研究使用GRN^+/?小鼠（RRID:MMRRC_036771-JAX）与人源TDP-43半合子转基因小鼠（hTDP+，RRID:IMSR_JAX:012836）进行杂交，后代经多代回交后分别获得半合子与纯合子研究队列。所有实验均包含相近比例的同窝雄性与雌性小鼠，动物实验经机构动物护理与使用委员会批准。行为学检测涵盖转棒实验、杆测试、钢丝悬挂实验、理毛实验、旷场实验及管测试，分别在3至18月龄间多时间点进行评估。组织制备采用心脏灌注取脑，分为右半球速冻用于生化分析及左半球固定切片用于组织学检测。分子生物学分析包括qPCR检测基因表达、ELISA定量颗粒蛋白前体蛋白水平、免疫印迹分析可溶性及不溶性组分中TDP-43与磷酸化TDP-43（pTDP-43, S409/410）水平、免疫荧光与免疫组化染色标记TDP-43、泛素、胶质细胞标记物、神经元标记物及炎症相关分子。成像与分析采用EVOS及共聚焦显微镜采集图像，通过FIJI与CellProfiler进行定量。溶酶体酶活性检测测定组织匀浆中组织蛋白酶D（cathepsin D, CatD）与β-己糖胺酶A（β-hexosaminidase A, HexA）活性。树突棘形态分析采用Lucifer Yellow离子透入标记mPFC层II/III锥体神经元，共聚焦成像后经Huygens去卷积与Neurolucida 360重建，定量棘密度、长度、头径及体积。转录组学分析包括额叶皮层bulk RNA测序（RNA-sequencing, RNA-seq）、rMATS-Turbo剪接分析、CLIPdb及eCLIP-seq数据重叠验证TDP-43结合位点，以及NanoString小鼠神经炎症面板检测皮层与海马区域炎症相关基因表达。统计学分析采用GraphPad Prism、IBM SPSS及R语言完成，根据数据类型选择线性混合效应模型、方差分析及事后检验，显著性阈值设定为p<0.05。所有数据已公开存储于GEO与Zenodo数据库。

结果

GRN^+/?:hTDP+小鼠的生成与表征

杂交后代的GRN与hTDP表达水平均符合预期基因型，两者无交互效应。行为学检测显示，hTDP+小鼠在3至15月龄间存在轻度运动障碍，但颗粒蛋白前体不足未加重该表型，GRN^+/?:hTDP+、GRN^?/?:hTDP+与GRN^+/+:hTDP+小鼠的运动表现无显著差异。

hTDP过表达加重颗粒蛋白前体单倍不足小鼠的社会支配缺陷

管测试结果显示，GRN^+/?:hTDP?小鼠在12月龄后出现年龄依赖性低社会支配表型；GRN^+/+:hTDP+小鼠未在任何单一时间点出现显著社会支配改变，但呈现与GRN^+/?:hTDP?相似的随龄降低趋势；而GRN^+/?:hTDP+小鼠在所有检测时间点（3至15月龄）均表现出显著的低社会支配表型，且在同基因型配对中亦持续低于GRN^+/?:hTDP?小鼠。

颗粒蛋白前体不足未促进hTDP+小鼠皮层的TDP-43聚集

10与18月龄hTDP+小鼠的运动皮层与额叶皮层均存在Ripa不溶性TDP-43水平升高，但颗粒蛋白前体不足未增加其水平，GRN^?/?:hTDP+小鼠在18月龄时甚至表现出低于GRN^+/+:hTDP+小鼠的不溶性TDP-43水平。pTDP-43免疫印迹与免疫染色均未检测到hTDP+小鼠皮层中存在特异性聚集信号，泛素免疫染色也未发现聚集相关升高，提示直至18月龄，颗粒蛋白前体不足未在hTDP+小鼠中诱导TDP-43聚集。

颗粒蛋白前体不足轻微增加hTDP+小鼠脊髓的不溶性TDP-43

脊髓分析中，GRN^?/?:hTDP+小鼠的不溶性TDP-43水平较GRN^+/+:hTDP+小鼠轻微升高，但未伴随运动功能恶化。

hTDP表达未加重颗粒蛋白前体不足小鼠的溶酶体表型

溶酶体储存标记物SCMAS免疫染色显示，GRN^?/?小鼠在10与18月龄均出现广泛升高，但hTDP表达无影响；溶酶体酶CatD与HexA活性在GRN^?/?小鼠中升高，同样不受hTDP表达调控。

半合子hTDP表达未加剧颗粒蛋白前体不足小鼠的神经炎症

小胶质细胞标记物CD68与星形胶质细胞标记物GFAP免疫染色显示，GRN^?/?小鼠在10与18月龄均出现显著升高，但hTDP表达未进一步增加其水平，GRN^+/?小鼠中也未出现hTDP诱导的反应性胶质增生。

GRN^+/?:hTDP+小鼠管测试后mPFC的c-Fos激活降低

10月龄GRN^+/?:hTDP+小鼠在同基因型管测试后，mPFC区域的c-Fos阳性细胞数显著低于野生型对手，而在丘脑背内侧核、基底外侧杏仁核与伏隔核区域则无差异，提示mPFC激活不足可能与低社会支配表型直接相关。

GRN与hTDP对mPFC树突棘的独立效应

mPFC层II/III锥体神经元树突棘分析显示，顶树突棘的密度、长度与头径在各基因型间无显著差异；而基树突棘中，hTDP表达显著降低棘密度，GRN基因型则独立影响棘形态——GRN^+/?小鼠的棘长度增加、头径减小，两种效应在GRN^+/?:hTDP+小鼠中叠加。

颗粒蛋白前体单倍不足改变TDP-43 RNA靶点的剪接

额叶皮层RNA-seq剪接分析显示，GRN^+/+:hTDP+与GRN^+/?:hTDP+小鼠均存在大量差异剪接事件，约40%位于TDP-43结合位点或结合基序附近，包含已知的TDP-43自调控及Psmd14等靶点外显子跳跃事件。两类小鼠的差异剪接事件重叠度极低，直接比较显示GRN^+/?:hTDP+小鼠存在332个差异剪接事件，其中129个靠近TDP-43结合区域，但无证据表明其为TDP-43整体功能改变所致。单独GRN^+/?:hTDP?小鼠的差异剪接事件更少，且仅有少量与GRN^+/?:hTDP+小鼠重叠。TDP-43亚细胞定位与内源性Tardbp自调控剪接分析均未发现两组hTDP+小鼠间的显著差异。

颗粒蛋白前体不足未增加hTDP++小鼠的TDP-43聚集

21日龄hTDP++小鼠的运动皮层存在高水平不溶性TDP-43、低分子量TDP-43片段及pTDP-43，但颗粒蛋白前体基因型不影响上述指标；pTDP-43免疫染色显示层V存在大量聚集体，GRN基因型亦不改变其负荷；泛素染色与细胞质TDP-43定位分析同样未发现颗粒蛋白前体不足的调控效应。

颗粒蛋白前体单倍不足增加TDP-43转基因小鼠的反应性胶质标记物

hTDP++小鼠皮层层V的CD68与GFAP免疫活性显著升高，其中GRN^+/?:hTDP++小鼠在运动与体感皮层的两种标记物水平均高于GRN^+/+:hTDP++小鼠；GRN^?/?:hTDP++小鼠呈现类似趋势但变异性较高。

GRN^?/?:hTDP++小鼠对皮层TDP-43病理表现出失调的炎症反应

NanoString神经炎症面板分析显示，所有hTDP++小鼠的皮层基因表达模式均显著区别于非转基因小鼠，共享136个差异表达基因；而GRN^?/?:hTDP++小鼠存在独特的表达谱，通路分析显示其NF-κB信号、DNA损伤与星形胶质细胞功能通路上调，少突胶质细胞与微胶质功能通路下调。差异基因中，髓鞘相关基因普遍下调，疾病相关小胶质细胞（disease-associated microglia, DAM）标记物Ms4a4a及多个DAM特征基因显著上调，但少突胶质细胞数量未发生明显变化。

GRN^?/?:hTDP++小鼠海马的神经炎症标记物改变

海马CA3区在21日龄时已发生严重神经元丢失，几乎无TDP-43聚集体残留。该区域CD68与GFAP免疫活性在hTDP++小鼠中升高，GRN^?/?:hTDP++小鼠的CD68呈升高趋势但无统计学差异；IgG沉积在GRN^+/+与GRN^+/?:hTDP++小鼠中显著存在，但在GRN^?/?:hTDP++小鼠中几乎消失，提示适应性免疫反应受损。局部未检测到抗原提呈细胞或浸润T细胞，但脾组织qPCR证实hTDP++小鼠的外周免疫细胞存在人源TARDBP表达，支持外周免疫应答参与IgG沉积的可能性。

讨论

本研究通过杂交颗粒蛋白前体不足小鼠与人源TDP-43转基因小鼠，证实颗粒蛋白前体不足虽未诱导或加重TDP-43聚集，但可显著加重FTD相关表型。GRN^+/?:hTDP+小鼠的社会支配缺陷与mPFC激活不足、树突棘密度与形态异常相关，提示mPFC神经元功能障碍是FTD-GRN行为改变的核心机制；GRN^+/?:hTDP++与GRN^?/?:hTDP++小鼠的神经炎症失调则表明，颗粒蛋白前体不足可放大对TDP-43病理的胶质反应并损害适应性免疫，这可能与FTD-GRN的快速进展特征相关。研究结果强调了颗粒蛋白前体在调控TDP-43依赖RNA剪接与神经炎症中的双重作用，为理解FTD-GRN发病机制提供了新的体内模型与机制线索。